霉菌毒素是由真菌产生的有毒有害物质。土壤、植物和青贮饲料中均可发现霉菌毒素。霉菌毒素既可在农作物大田收获时形成，在不适宜的贮存条件下，也可继续在收获后的农作物上形成。较高的湿度通常有利于饲料中霉菌的生长和霉菌毒素的产生。饲料中检出率比较高和对动物影响比较大的霉菌毒素主要有黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和呕吐毒素。
黄曲霉毒素主要是黄曲霉菌和寄生曲霉菌的二次代谢产物，其化学结构类似，均为二氢呋喃香豆素的衍生物。一般来说，温度30℃、相对湿度80%、谷物水分在14%以上（花生的水分在9%以上）最适合黄曲霉菌繁殖和生长。在24～34℃，黄曲霉菌产毒量最高。
呕吐毒素又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇，主要是由禾谷镰刀菌和黄色镰刀杆菌产生的化学结构和生物活性相似的有毒代谢产物（单端孢霉烯族化合物中的一种）构成，主要污染小麦、大麦、玉米等谷类作物，也污染粮食制品。人和动物在误食被该毒素污染的粮谷类后可以产生广泛的毒性效应。
玉米赤霉烯酮又称F2毒素，是由禾谷镰刀菌等菌种产生的有毒代谢产物，是一种雌激素真菌毒素。玉米赤霉烯酮主要污染玉米、麦类、谷物等，在世界各地各种粮谷与饲料中均有存在。玉米赤霉烯酮具有较强的生殖毒性和致畸作用，可引起动物发生雌激素亢进症，导致动物不孕或流产，对家禽、猪、牛和羊的影响较大，给畜牧业带来很大的经济损失。
霉菌毒素的生物降解是近年来国内外霉菌毒素脱毒技术方面的一个研究热点。徐剑宏等用脱氧雪腐镰刀菌烯醇多次传代富集培养从小麦的土壤中分离到一株霉菌毒素降解菌，该菌对不同单端孢霉烯族毒素的降解率达到90%以上。牛天贵等用香豆素为唯一碳源的培养基，以动物粪便、发霉粮食、腐败饲料、枯枝败叶和发酵食品为实验材料，先进行初筛，获得能降解香豆素的菌株，再分别以黄曲霉毒素B1或赭曲霉毒素A为唯一碳源的培养基进行第2次筛选，结果获得一株对黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A均能降解的地衣芽孢杆菌。进一步试验表明，此地衣芽孢杆菌对玉米面中低浓度和高浓度的黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A均能有效降解，降解率分别达到82.9%、78.3%和75.0%、73.5%。陈志敏等分别将黄曲霉毒素降解菌、玉米赤霉烯酮降解菌和呕吐毒素降解菌进行发酵培养，然后通过固液分离、超滤浓缩获得3种细菌的霉菌毒素降解酶液，复合配制成霉菌毒素降解酶制剂，对饲料霉菌毒素的去除率达到80%以上。这些研究表明应用酶解技术降解饲料中的霉菌毒素具有很好的应用前景。
产酶益生素可以提高畜禽对日粮的消化利用率，减少粪便排放量，提高畜禽的生产性能。芽孢杆菌以芽孢形式存在时，对环境的抵抗力强，在适宜条件下又可复活，恢复生物学功能。因此，芽孢杆菌是生产益生素的良好菌种。本研究旨在筛选对黄曲霉毒素B1、呕吐毒素和玉米赤霉烯酮均有较好降解作用的芽孢杆菌，以便为开发具有霉菌毒素降解作用的新型产酶益生素奠定基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1猪粪
安徽九鼎农业科技发展股份有限公司原种场中的健康成年母猪正常粪便。
1.1.2培养基
营养琼脂培养基：蛋白胨0.5 g、牛肉膏0.3 g、琼脂1.5 g、蒸馏水100 mL，pH7.2～7.4。
富集培养基(牛天贵，2009)：(NH4)2HPO40.1 g、KH2PO40.1 g、Na2HPO40.2 g、Na2SO40.05 g、NaNO30.1 g、3种霉菌毒素(黄曲霉毒素B1、呕吐毒素和玉米赤霉烯酮)适量(第1、2和3次富集浓度分别为1、5、10 mg/L)、蒸馏水100 mL，pH7.2～7.4。
霉菌毒素降解菌定向筛选培养基(牛天贵，2009)：蛋白胨0.5 g、牛肉膏0.3 g、霉菌毒素0.5 mg、蒸馏水100 mL、pH 7.2～7.4。
1.1.3主要试剂
玉米赤霉烯酮、呕吐毒素和黄曲霉毒素标准品购自天津一方科技有限公司。玉米赤霉烯酮、呕吐毒素和黄曲霉毒素的ELISA检测试剂盒购自北京华安麦科生物技术有限公司。
1.1.4主要仪器
手提式高压灭菌锅（上海锐风仪器制造有限公司）、SW-CJ-2FD双人单面超净工作操作台（苏州净化设备有限公司）、PRO全自动微生物生长曲线分析仪（BIOSCREEN C 公司）、318MC型酶标仪（上海三科仪器有限公司）。
1.2方法
1.2.1霉菌毒素降解菌的富集培养
称取0.5 g母猪粪便放入灭菌试管中，加入5 mL灭菌生理盐水，用灭菌吸管充分吸吹混匀。用无菌纱布封好试管口后，放入80℃水浴中加热15 min杀死非芽孢菌，取出冷却后，用无菌生理盐水按100倍、1 000倍、10 000倍梯度稀释样品。分别取各稀释度的样品溶液100μL涂布接种于营养琼脂培养基平板上，37℃培养7 d，直到菌落充分长出。
将各平板上长出的菌落用灭菌生理盐水洗下，混合后作为原始菌液，约8 mL。将原始菌液放入80℃水浴中加热15 min以充分杀死非芽孢菌，冷却后吸取100μL涂布接种于营养琼脂平板上，37℃培养24 h。将长出的菌落用5 mL灭菌生理盐水洗下，吸取100μL菌液接种到5 mL第1次富集培养基中，37℃振荡培养1周。取100μL第1次富集培养菌液，传代接种于5 mL第2次富集培养基中，37℃振荡培养1周，再取100μL所得培养物，传代接种于5 mL第3次富集培养基中，37℃振荡培养1周。这样共传代富集3次。
1.2.2霉菌毒素降解菌的定向筛选
1.2.2.1能降解呕吐毒素的芽孢杆菌定向筛选
将最终富集培养获得的菌液10 000 r/min离心15 min，弃上清液，向沉淀中加入无菌生理盐水5 mL，10 000 r/min离心15 min，弃上清液，同法清洗3次以除去富集培养菌液中残留的富集培养基液。最后一次离心获得的细菌沉淀，用5 mL灭菌生理盐水悬浮。取100μL菌液接种于5 mL呕吐毒素降解菌定向筛选培养基中，37℃振荡培养48 h。用接种环蘸取菌液划线接种于营养琼脂培养基上，37℃培养24 h。挑取营养琼脂平板上长出的单菌落分别接种于5 mL呕吐毒素降解菌定向筛选培养基中，37℃培养48 h。分别将各单菌落的培养液在10 000 r/min离心15 min，吸取各自上清2 mL，用呕吐毒素ELISA检测试剂盒测定呕吐毒素含量（T1），测定方法参照试剂盒说明书。以呕吐毒素降解菌定向筛选培养基的呕吐毒素含量（T0）为参照，计算各单菌落对呕吐毒素的降解率：x(%)=（T0-T1）/T0×100%。
1.2.2.2能降解玉米赤霉烯酮的芽孢杆菌定向筛选
将对呕吐毒素降解率达70%以上的呕吐毒素降解菌分别转接到玉米赤霉烯酮定向筛选培养基中，37℃培养48 h。参照呕吐毒素降解率的测定方法，用玉米赤霉烯酮ELISA检测试剂盒检测玉米赤霉烯酮含量，并计算培养后玉米赤霉烯酮的降解率。
1.2.2.3能降解黄曲霉毒素B1的芽孢杆菌定向筛选
将对玉米赤霉烯酮降解率达70%以上的玉米赤霉烯酮降解菌分别转接到黄曲霉毒素B1定向筛选培养基中，37℃培养48 h。参照呕吐毒素降解率的测定方法，用黄曲霉毒素B1 ELISA检测试剂盒检测培养前后培养液中黄曲霉毒素B1含量，并计算培养后黄曲霉毒素B1的降解率。
1.2.3目标细菌的形态观察
选取对呕吐毒素、玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素B1综合降解率最理想的菌种作为目标菌种。将目标菌种划线接种于营养琼脂培养基上，37℃培养24 h。观察记录菌落形态。挑取单菌落，制成涂片，分别进行革兰氏染色和美兰染色，观察其菌落形态。