结果
为了鉴定可用于提高木糖糊精利用的XD转运体，我们对密码子优化的CDT-1和CDT-2转运体直系同源物进行了筛选，命名为STX（X从1到17）（表1）。系统发育分析表明，CDT-2的直系同源物在真菌界广泛分布，表明许多真菌能够利用来源于植物细胞壁的木糖糊精（图1）。这些直系同源物与CDT-2的氨基酸序列同一性为28-67%。
图1. CDT-1和CDT-2相关转运体的系统发育树。 标明了鉴定每种转运体的物种名称，NCBI基因ID和蛋白质序列包含在表1中。
图2. 转运体的细胞定位。 携带CDT-1-GFP、CDT-2-GFP和STX-GFP（ST1至ST17）转运体的酿酒酵母菌株D452-2细胞的落射荧光显微镜图像。除ST5、ST8、ST10和ST14外，转运体主要定位于质膜。
我们首先构建了在C末端与增强型GFP融合的ST1-ST17表达质粒，使用强启动子TDH3和终止子CYC1，并在酿酒酵母菌株D452-2中表达这些转运体。使用落射荧光显微镜，我们发现大多数转运体定位于质膜（图2）。转运体ST5、ST8、ST10和ST14分散在细胞质或液泡中（图2），表明这些转运体在酿酒酵母中折叠不良，因此未对其进行分析。
木糖糊精，包括木二糖和木三糖，是聚合度不同的β-1,4-连接的木糖寡聚物。作为对纤维二糖（G2）、木二糖（X2）和木三糖（X3）转运活性的直接测试，我们选择了定位于质膜的转运体（图2）并进行了基于酵母细胞的糖摄取实验。值得注意的是，我们发现ST3、ST15和ST16是XD特异性转运体，而其他显示XD转运活性的转运体也能转运纤维二糖，尽管总体活性各不相同（图3）。CDT-2对X2和X3的摄取活性是ST9、ST11和ST12的十倍以上（图3）。因此，这些转运体未进一步研究。ST转运体的糖偏好性总结并显示在系统发育树上（图S1）。
图3. ST转运体对纤维二糖和木二糖的体内摄取。 A）纤维二糖（G2），B）木二糖（X2）和C）木三糖（X3）从表达ST转运体的D452-2细胞中的摄取。细胞在含200 μM糖的缓冲液中孵育。在t = 0分钟和t = 30分钟测量多糖浓度。消耗的糖浓度归一化为1 OD单位的细胞。测量值代表平均糖摄取量及相应的生物学重复标准误。
许多转运体受到细胞外培养基中相关糖存在的抑制。例如，木糖转运体受到葡萄糖存在的抑制，这导致了许多试图解除这种抑制的研究。我们此前观察到纤维二糖抑制CDT-2对木二糖的转运。因此，我们在纤维二糖摩尔浓度逐渐增加（最高达X2浓度的10倍）的条件下测试了木二糖转运活性。有趣的是，我们发现纤维二糖不抑制ST3、ST15和ST16对木二糖的摄取（图4），这使它们成为在多种预处理情景下与来自木质纤维素生物质的葡萄糖或纤维糊精共发酵的良好候选者。然而，对于其他转运体，当培养基中G2摩尔浓度增加时，每OD消耗的X2减少，如CDT-2所示（图4）。
图4. 木二糖与纤维二糖摄取之间的竞争。 在表达ST转运体的细胞中，纤维二糖浓度逐渐增加时木二糖的摄取。细胞在含200 μM X2以及G2与X2比例逐渐增加的缓冲液中孵育：0X、1X和10X X2浓度。测量值代表每个所示比例的生物学三个重复在30分钟孵育后消耗的平均X2，以及标准误差线。
为了进一步将糖摄取活性与酵母生长相关联，我们使用CRISPRm（图S2）对消耗木糖的酿酒酵母菌株SR8进行工程化，将GH43-2和GH43-7分别插入TRP1和LYP1位点。工程化的SR8菌株命名为SR8A。携带不同转运体表达质粒的酵母菌株SR8A细胞在oMM培养基中好氧培养96小时，以木糖糊精为唯一碳源。ST2和ST16使酿酒酵母在木糖糊精上生长更快（图5）。ST2和ST16的曲线下面积（AUC）分别比CDT-2高1.16倍和1.26倍。尽管ST3不受纤维二糖存在的抑制（图4），但它未能使酿酒酵母比ST2和ST16生长得更好（图5），因此未进一步分析。我们还测试了ST2和ST16转运体在XD加蔗糖条件下的厌氧生长特征，但与CDT-2相比，厌氧条件下没有显著改善。
图5. ST转运体在木糖糊精上的好氧生长特征。 A）携带质粒表达CDT-2的SR8A菌株长达96小时的生长曲线，曲线下面积（AUC）用阴影表示。显示了一个代表性实验，在好氧条件下以木糖糊精为唯一碳源。B）携带质粒表达不同ST转运体的SR8A菌株的AUC。AUC绘制为ST与CDT-2 AUC比值的log2。所有实验均进行生物学三个重复，误差线代表标准差。
综上所述，我们从筛选中鉴定出三种潜在有用的木糖糊精转运体，每种都有不同的优缺点（表1）。其中，ST16是一种XD特异性转运体，显示出更快的好氧生长，其木二糖转运活性不受纤维二糖抑制。因此，我们选择来源于绿色木霉的ST16作为起点，建立定向进化实验以改进XD消耗。基于先前发表的实验，其中XD消耗在厌氧条件下被快速开启和关闭，我们假设XD转运在消耗速率方面是限制因素。值得注意的是，当我们将受PGK1启动子和TPS3终止子控制的转运体ST16插入酵母基因组的LEU2位点时，与从质粒过表达ST16相比，生长速率显著下降。此外，整合ST16的菌株生长几乎与对照一样慢（图6A）。GFP荧光发射光谱证实ST16从染色体表达，但水平低于从质粒过表达（图6B）。
图6. 与基于质粒的表达相比，转运体ST16的染色体表达减慢了好氧生长。 A）比较携带质粒表达CDT-2、ST16或空载体的酵母SR8A菌株与在LEU2位点从染色体拷贝表达ST16转运体的菌株的好氧生长特征。误差线代表生物学三个重复的标准差。B）ST16-GFP融合表达的GFP荧光发射光谱分析。ST16，缺乏GFP融合的细胞用于确定基线荧光。
为了进一步测试转运是否是XD利用菌株中的限制因素，我们比较了携带表达CDT-2、GH43-2和GH43-7质粒的SR8菌株与SR8A菌株的好氧生长特征，SR8A菌株的GH43-2和GH43-7从染色体拷贝表达，且仅携带表达CDT-2转运体的质粒。我们推测，将GH43-2和GH43-7基因整合到染色体中会降低蛋白质表达水平，与使用质粒过表达相比，因为质粒的拷贝数要高得多。正如XD转运是XD利用的限制因素所预期的那样，从染色体表达GH43-2和GH43-7不影响在木糖糊精上的好氧生长（图S3）。这些结果进一步支持XD转运体是XD利用途径的限速步骤。
接下来，我们尝试开发一种CRISPR-Cas9介导的定向进化选择实验，使用液体培养基中的生长，然后基于菌落大小进行筛选。我们首先使用易错PCR生成ST16的突变体文库，包含2×10³个变体，并将文库转化到SR8A菌株中。来自YPAD+G418平板的混合菌株在含有XD的液体合成培养基中好氧生长2天，然后涂布在含有XD的合成培养基平板上，以富集功能性ST16突变体。令人惊讶的是，在平板上好氧生长4天后，所有菌落大小相似，我们无法识别出任何表现出更快好氧生长的单个菌落。此外，我们在制作合成平板时对木糖糊精浓度进行了系列稀释，发现选择策略的主要障碍是菌株在污染的木糖和氨基酸上的背景生长（图S4），导致难以识别功能性ST16突变体。因此，酵母菌株能够在除XD以外的替代碳源上生长，从而规避了XD依赖性生长的选择压力。
讨论
CDT-1和CDT-2是粗糙脉孢菌在纤维素降解中使用的两种重要纤维糊精转运体，其中只有CDT-2也参与半纤维素的利用。在先前的结果中，由转运体CDT-2和两种β-木糖苷酶GH43-2和GH43-7组成的木糖糊精消耗途径的发现，为利用来源于半纤维素的木糖提供了新模式。然而，从粗糙脉孢菌分离的XD途径需要显著改进才能用于未来的工业应用。在我们的研究中，我们证实XD转运体是XD利用途径的限速步骤（图6A和图S3）。通过对CDT-1和CDT-2转运体直系同源物文库的表征，我们鉴定了来自其他真菌的三种潜在转运体，可用作探索更快木糖糊精利用的靶标（表2）。其中，来源于绿色木霉的转运体ST16相比CDT-2具有优势，包括它是一种具有良好膜定位的XD特异性转运体，并能实现更快的好氧生长。此外，ST16的木二糖转运活性不受纤维二糖存在的抑制。
鉴于ST16转运体的优越特性，我们尝试开发一种CRISPR-Cas9介导的定向进化实验，以ST16为起点筛选可进一步提高木糖糊精利用效率的突变体。我们使用含XD的液体培养基进行选择，随后在含XD平板上筛选更大菌落。通过诱变和染色体整合，我们筛选了2×10³个ST16突变体。然而，由于这些菌株在木糖和氨基酸上的背景生长，我们很难选择大菌落，导致难以识别更具功能性的ST16突变体。这种背景生长是一个问题，因为这些菌株在XD上生长缓慢，这与纤维二糖转运体定向进化中较高的初始生长速率形成对比。
为了克服当前选择策略的剩余瓶颈，需要从XD制备物中去除污染的木糖，并尽量减少培养基中的氨基酸浓度。此外，还需要进行进一步的实验来提高染色体整合ST16的表达水平，因为我们发现使用PGK1启动子不足以驱动在含XD平板上的生长超过背景水平。虽然不理想，但可能需要首先使用从质粒表达ST16进行定向进化，以提高ST16表达水平。其他策略也可用于XD转运体的定向进化，包括从ST2或ST15开始。或者，对CDT-2等纤维糊精转运体进行定向进化实验以改进纤维二糖摄取，然后测试分离的突变是否也能促进更快的XD摄取，这可能是有用的。
尽管ST2和ST16都未能比CDT-2改善XD的厌氧利用，但根据我们先前的结果，木糖或其他简单糖的存在可用于启动XD的消耗。基于XD消耗在厌氧条件下的快速关闭和开启，我们怀疑XD转运体在缺乏己糖或木糖时被内化。目前，CDT-2和ST16在仅含木糖糊精培养基中的调控方式仍不清楚。其他系统水平的实验，如转录和核糖体分析，也可用于更好地理解酵母菌株在厌氧条件下感知木糖糊精的机制。最后，XR/XDH途径的辅因子不平衡问题可能导致培养上清中木糖的积累，表明代谢感知和木糖同化途径可能需要额外调整以实现最佳的木糖糊精利用。
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