4. 讨论
4.1. 生物膜形成
食品加工环境中形成的生物膜是食品工业公认的问题，因为它们有可能成为导致食品被致病和腐败微生物污染的源头，这可能引起疾病传播并产生重大的财务影响。已证明生物膜中的致病细菌是食品污染的主要来源。生物膜增加微生物对化学、物理和生物制剂的抗性，形成生物膜的能力已被确定为细菌在食品加工设施中持久性的重要因素。结晶紫法被认为是评估生物膜形成的合适技术，因为它产生可重复的结果，允许同时研究大量菌株和条件。此外，该方法通过测量孔的光密度提供定量结果。已证明微量滴定板法与沙门氏菌生物膜形成之间存在相关性。
本研究的结果显示，所有测试的肠道沙门氏菌分离物都具有在聚苯乙烯表面上产生生物膜的能力。这些发现令人担忧，因为塑料材料经常在农场、屠宰场、食品加工工业和厨房中使用，用于建造储罐、管道、配件和切割表面。先前的研究表明，使用聚苯乙烯微孔板体外生物膜产生与食品设施中不同材料表面上的生物膜形成之间存在相关性。
已证明包括沙门氏菌在内的细菌在疏水（橡胶和塑料）表面上的粘附数量多于亲水（玻璃和不锈钢）表面。考虑到粘附是生物膜形成过程的第一步，这可能是沙门氏菌在塑料表面上产生生物膜能力相当强的一个可能解释。本研究中沙门氏菌菌株记录的OD580值（从0.126±0.012到2.745±0.033）与其他作者使用结晶紫染色微孔板法在聚苯乙烯表面上观察到的数值范围一致。
目前很少有研究描述从家禽分离的沙门氏菌形成生物膜的能力。Ramesh等人研究了沙门氏菌菌株在家禽运输容器镀锌钢表面上形成生物膜的情况。这些作者观察到五株沙门氏菌菌株（鼠伤寒沙门氏菌、汤普森沙门氏菌、贝塔沙门氏菌、哈达尔沙门氏菌和约翰内斯堡沙门氏菌）具有附着到这些金属表面的能力。Marin等人表明，从肉鸡和蛋鸡饲养舍表面分离的50%的沙门氏菌菌株能够产生生物膜。
本研究的结果表明，沙门氏菌形成生物膜的能力是血清型依赖的。因此，这构成了不同血清型之间变化的毒力因素，正如其他作者所建议的那样。与本研究的发现一致，Patel和Sharma观察到沙门氏菌菌株的附着和随后的生物膜形成可以根据血清型的特定性质而有所不同。阿戈纳沙门氏菌是一种经常从禽肉中分离的血清型，是近年来欧盟与人类沙门氏菌病最相关的十大血清型之一。2008年，共确认了120,760例人类沙门氏菌病病例，阿戈纳沙门氏菌占636例（0.5%）。Vestby等人在测试来自鱼粉和饲料工厂的菌株时，使用微量滴定板和结晶紫染色观察到阿戈纳沙门氏菌形成生物膜的强大能力。在这些作者测试的四种血清型（阿戈纳沙门氏菌、蒙得维的亚沙门氏菌、森夫滕贝格沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌）中，鼠伤寒沙门氏菌显示产生生物膜的能力最低。Bridier等人在另一种生物膜模型（使用细胞渗透性绿色荧光核酸标记和共聚焦激光扫描显微镜图像采集的微量滴定板）中证明，阿戈纳沙门氏菌菌株比其他测试的血清型（圣保罗沙门氏菌、勃兰登堡沙门氏菌、德比沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、哈达尔沙门氏菌、印第安纳沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌）产生更好的生物膜，这与本研究的观察结果一致。另一方面，Kim和Wei报告说鼠伤寒沙门氏菌（特别是DT104）和海德堡沙门氏菌菌株比阿戈纳沙门氏菌产生更强的生物膜。
伤寒沙门氏菌是伤寒（也称为肠热病）的病原体。这种疾病在全世界仍然是一个严重的公共卫生问题，特别是在发展中国家，估计每年有1600万至3300万例病例和50万至60万例死亡。西班牙每年记录10至34例人类疾病病例。由于伤寒的严重性和相当高的死亡率（高达10%-20%），伤寒沙门氏菌形成生物膜的能力引起了极大的公共卫生关注。该疾病通过患者和携带者的粪便和尿液污染的食物和水传播。一个令人担忧的问题是2%-5%的患者成为慢性携带者。
本研究中使用的伤寒沙门氏菌菌株根据Stepanovic等人建议的标准被归类为强生物膜形成者（OD580 = 1.158±0.098）。目前关于伤寒沙门氏菌形成生物膜能力的信息有限。与本报告的结果一致，Pui等人报告伤寒沙门氏菌在塑料砧板上的生物膜形成显著高于鼠伤寒沙门氏菌（P < 0.05）。
4.2. 生长动力学参数
修正的Gompertz方程被认为适合描述体外细菌生长（OD420-580），因为观察到的实验值和预测值之间具有良好的吻合度。
本研究的一个重要结果是观察到沙门氏菌血清型之间生长动力学参数存在重要差异。然而，应该指出，测试菌株所属的10种血清型代表性不均等，纽波特沙门氏菌、德比沙门氏菌和伤寒沙门氏菌各由两株菌株代表。因此，关于生长参数与本研究中代表性更多的分离物血清型之间关联的陈述可能更为明智。尽管不同食源性病原体（主要是单核细胞增生李斯特菌）的生长动力学已与表型或基因型特征相关联，但沙门氏菌尚未获得类似发现。相反，比较属于各种血清型的肠道沙门氏菌菌株生长动力学行为的研究未发现血清型效应。因此，Oscar发现代表11种不同血清型的11株肠道沙门氏菌菌株在延迟时间和比生长速率方面只有微小差异。Juneja等人研究了10株沙门氏菌临床和食品分离物在19°C和37°C脑心浸液肉汤中生长和热抗性动力学方面的血清型特异性差异。这些作者观察到生长动力学中只有很小的血清型间变异，得出结论认为，如果有的话，与实验变异性相比，血清型效应预计是有限的。Lianou和Koutsoumanis报告了类似的发现，他们研究了60株沙门氏菌（9种血清型）在不同pH值和NaCl浓度的TSB中的生长，并观察到在任何评估的生长条件下，最大生长速率值与肠道沙门氏菌菌株的血清型无关。
图3显示光密度和平板计数之间具有良好的吻合度（r = 0.952），可以使用合适的关系进行拟合。与平板计数相比，浊度法仅在7.5-10 log10 cfu/mL范围内给出线性关系。因此，将7.5至10 log10 cfu/mL的数据纳入校准曲线，最大限值为30小时孵育。这些结果与其他研究一致，这些研究表明该方法无法检测低于约10^7细胞/mL的细胞浓度。另一方面，30小时孵育后的数据不再呈线性，被丢弃。这是因为到生长指数期末期，细胞死亡发生，随后平板计数减少。然而，浊度测量确定活细胞和非活细胞，因此由于细胞死亡不会观察到光密度的降低。
4.3. 生物膜形成与生长动力学参数之间的关系
如前几段所述，其他作者先前已对沙门氏菌的生物膜形成进行了评估。然而，没有关于生物膜形成与生长动力学之间关系的数据。
细菌生物膜以多个阶段形成：（i）细胞在固体表面上的初始可逆吸附，（ii）产生表面多糖或荚膜材料，随后形成胞外聚合物基质导致不可逆附着，（iii）生物膜结构的早期发展，以及（iv）生物膜的成熟和单个细胞从生物膜中分散。本研究的结果表明，当考虑每种血清型中的菌株时，测试菌株的生长动力学与其产生生物膜的能力无关。
一些研究表明，附着沙门氏菌细胞的数量随培养肉汤中细菌密度的增加而线性增加。因此，Jain和Chen观察到沙门氏菌在聚苯乙烯表面上的生物膜形成在孵育期间显著增加，Dunsmore和Bates注意到几种乳源性微生物在12小时内的粘附存在广泛的变异性。在其他情况下，据报道附着细胞的数量在孵育期间保持恒定。
根据几位作者的说法，沙门氏菌对非生物表面的附着发生在培养肉汤中孵育12小时内。可能在孵育几小时后，表面达到饱和水平，更多的浮游细胞不会导致更多的附着细胞。这可能是本研究中24小时孵育后生物膜形成与沙门氏菌菌株生长动力学之间没有任何关系的可能解释之一。
总之，测试的肠道沙门氏菌分离物具有在聚苯乙烯表面上形成生物膜的能力。对于属于阿戈纳沙门氏菌和伤寒沙门氏菌血清型的菌株，这种形成生物膜的能力相当强。由于塑料材料在食品加工和烹饪设施中被广泛使用，高产生物膜能力的沙门氏菌菌株对塑料表面的污染可能产生严重的健康和经济后果。因此，强调家禽业需要定期卫生计划和实施升级的危害分析和关键控制点（HACCP）系统以避免生物膜形成，特别是当检测到强生物膜形成者的沙门氏菌菌株时。测试菌株的生长动力学是血清型依赖的。血清型之间在微生物生长动力学方面观察到的变异性是食品安全研究的一个重要特征，强调筛选广泛测试菌株范围以获得沙门氏菌不同行为代表性观点的重要性。在考虑每种血清型时，未观察到生长动力学参数与沙门氏菌菌株产生生物膜能力之间的关系。
致谢
本研究由卡斯蒂利亚-莱昂自治区资助。
相关新闻推荐
1、引起甜樱桃流胶的病原菌SXYTLJ01生物学特性研究（一）
2、宁夏引黄灌区稻蟹共作(EG)土壤理化指标和微生物群落结构测定（二）
3、猪链球菌2型生长曲线绘制、毒力因子基因鉴定及小鼠致病性试验（二）