摘要
在实际应用中，食品往往受到低水平的食源性病原体污染。然而，其巨大的潜在风险不容忽视，因为微生物可能在食品链（如运输或储存）中的适宜条件下开始高速生长。因此，对微生物单细胞进行预测建模具有重要意义。本综述涵盖了微生物单细胞建模的几个关键方面。首先，基于先前的研究，详细介绍了微生物单细胞数据采集和生长数据收集的技术。此外，还总结了微生物单细胞变异性的来源。为了模拟微生物生长，传统的确定性数学模型已被开发出来。然而，由于细胞间的高度异质性，大多数模型在低细胞数量或单细胞水平上无法做出准确预测。随机模型引起了人们的极大兴趣；这些模型考虑了微生物单细胞行为的变异性。
1. 引言
近年来，全球范围内即食食品的消费量有所增加。这类食品保留了重要的营养成分、特有的新鲜度和特殊风味。与这种潜在益处相反，由于食用被金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、空肠弯曲菌、沙门氏菌属和单核细胞增生李斯特菌等食源性病原体污染的即食食品而导致的食物中毒事件时有发生。污染可能发生在采后、运输、储存、加工、包装和销售阶段。美国疾病控制与预防中心和许多研究报告了许多即食食品与食物中毒爆发有关。因此，日益增多的食物中毒事件要求食品工业界付出巨大努力来提高微生物安全性并确保食品质量。
迄今为止，大量研究集中在消毒技术、亚致死损伤细菌以及微生物生长的预测建模上。其中许多研究是在群体水平上使用高接种量进行的。然而，食品最初主要是被低水平的微生物污染的。例如，初始污染水平可能为每克10个细胞。此外，已有证据表明，单个微生物细胞能够快速生长并导致食源性疾病。因此，应进行定量微生物风险评估，并使用微生物单细胞的预测模型。
关于单个细胞生长参数的信息对于研究非常有价值，因为单细胞：(1) 可能意外地缩短群体细胞的延滞期；(2) 反映了细胞的历史；(3) 可能在新环境（如储存、包装等）中存活、恢复和生长。因此，准确预测食品中小接种量或单细胞的生长对于提高食品安全至关重要。这促使研究人员关注单个细胞的生长行为。
在单细胞建模研究中，最重要的一步是单细胞获取。有许多获得单细胞的技术，包括连续稀释法、流式细胞术和荧光激活细胞分选法、流动室法、微流控法和显微操作法。每种技术都有其自身的优势和缺点。因此，选择合适的细菌单细胞获取方法对于模拟生长和/或失活可能非常重要。
理论上，四个主要动力学参数用于表征细菌行为模型，即初始细胞密度、延滞期、生长速率和最大细胞密度。延滞期在生物学上定义为细胞积累足够分裂所需物质的时间。延滞期之后，以特定的生长速率进行大规模扩增，直到微生物达到对应于最大细胞密度的稳定期。由于单细胞行为的高度变异性，需要更精确和高通量的方法来有效获取单细胞生长数据。光学技术在早期尚不成熟。光密度测量很方便，但连续分析对于监测单细胞生长具有优势。然而，它无法直接观察细胞，因此需要更精确有效的观察方法，包括显微镜、流式细胞术、流动室显微镜系统和芯片实验室方法。
此外，已经提出了大量的确定性模型来模拟微生物。这些确定性模型有一组恒定的动力学参数（例如，N₀, λ, μ_max），并且在高微生物数量下工作得相当好。对于低接种水平，由于未能估计单细胞的变异性，确定性模型可能导致意想不到的偏差。单细胞生理状态的变异性主要受以下因素影响：(1) 固有的生物学变异性（例如，基因表达、酶活性等）和 (2) 环境因素，如食品特性和食品链条件。在为单个细胞建模时，应考虑这些变异性因素。在过去十年中，随机模型得到了发展，它们更适合于模拟低接种水平或单细胞水平。早期对单细胞行为的研究集中在单个延滞期的分布上。随后，单细胞的生长概率引起了研究人员的注意。最近，为了更准确的微生物风险评估，食品特性的变异性也被考虑在内。
本综述涵盖以下主题：首先，第2节介绍了个体细胞的获取技术。接下来，第3节描述了收集生长数据的方法。然后第4节主要关注不同因素如何影响细胞间生理状态的变异性。第5节讨论了单细胞随机模型中参数的分布。最后，在第6节中，讨论了结论和未来可能的趋势。
2. 单细胞的分离
分离单细胞是个体细胞预测建模的基本但困难的一步。在本节中，将详细介绍几种常见的单细胞分离技术，如连续稀释法、荧光激活细胞分选系统、流动室法、微流控法和显微操作法。每种技术都有其自身的优点和局限性（表1）。因此，方法的选择将取决于研究目的。
| 单细胞获取技术 | 优点 | 缺点 |
|---|---|---|
| 连续稀释法 | 低成本且方便 | 精度低（随机性） |
| 荧光激活细胞分选(FACS) | 高通量分析和高精度 | 昂贵 |
| 微流控方法 | 高通量分析、低成本且方便 | 具有一定的随机性（与分隔技术结合时） |
| 显微操作方法 | 高精度 | 通量低且难以执行 |
2.1. 连续稀释法
连续稀释法是获得单细胞的经典且广泛使用的方法。通常，将连续稀释的培养悬浮液接种到多孔板中，并进行两倍稀释，使得每个孔中大约有一个细胞。理论上，如果按预期方式进行稀释，每个细胞有50%的机会留在原孔中，同时有50%的机会转移到下一个孔中。然而，实际上，连续稀释并不遵循所描述的模式，必定会有一些空孔。因此，连续稀释法的最大挑战是保证每个孔中确实存在一个单细胞。一般来说，每个孔中含有i个细胞的概率P可以假设服从期望值为β的泊松分布（图1）：
图1. 泊松分布示意图，显示每个孔中含有不同数量细胞（i=0, 1, 2, ...）的概率，给定每个孔的平均细胞数（β）。这在连续稀释法中用于估计获得单细胞的概率。
通常，如果考虑更多的列，则获得单细胞的确定性更高。研究者提出，如果只有一行的最后一个孔显示生长，那么非空孔中含有单细胞的概率大约只有37%。而另一些研究者报告说，如果观察到平板的最后五列，则有高达80%的概率获得单细胞。然而，使用这些方法的实验需要大量的重复测量。另有研究者指出，可以利用空孔的数量来估计每个孔中的细胞数量，前提是假设每个孔中的初始细胞数服从截断的泊松分布，公式如下：
其中 w₀ 是空孔的数量，w 是孔的总数。
总的来说，连续稀释法简单且便宜，但由于稀释的随机分布，不能保证每个孔中都有一个单独的细胞。
2.2. FCM-FACS法
图2. 荧光激活细胞分选(FACS)系统工作原理示意图。细胞在流束中排列成单行，经过激光检测区。根据荧光信号，液滴被充电并偏转至相应的收集容器中。
流式细胞术结合荧光激活细胞分选是另一种用于分离单个细胞的强大技术（图2）。简而言之，FCM-FACS系统的工作原理如下：首先，通过控制系统压力和喷嘴尺寸，只允许流束中的单个细胞通过照明检测区域。然后，通过强烈振动形成微小液滴，每个液滴只包含一个单独的细胞，该细胞被静电充电并在电场的作用下转向不同的收集容器。FCM-FACS系统的优点包括多参数数据采集、高通量分析（>10⁴ 细胞/秒）和高单细胞率。然而，大的单细胞可能在分选过程中受损，而小细胞则可能残留下来，导致更长的延滞期。与连续稀释法相比，FCM-FACS可能相当昂贵，原因是仪器成本高昂。
2.3. 流动室法
流动室法基于流体力学，可用于分离单细胞。研究者曾提出使用流动液体介质在膜上分离细胞。然而，该方法的主要问题是子细胞去除不充分。为了克服这一限制，其他研究者改进了该方法，使用一个流动室，其中细胞紧密附着在固体表面上，高速流动会冲走任何后代细胞，而不会移除原始细胞。这一改进使得流动室法因其高精度和便利性而被广泛应用于许多单细胞实验中。然而，需要注意的是，该系统可能不适合研究那些对固体表面粘附性差的单个细胞（例如，大肠杆菌）。
2.4. 微流控法
通常，微流控技术需要物理知识，包括气压、液压、电压、介电泳力和磁场，以分离或捕获单个细胞。一个例子是微制造荧光激活细胞分选器。简而言之，μFACS系统通过在检测到荧光信号后改变狭窄通道中的流动方向来获得单细胞。另一个实例是介电泳激活细胞分选器。在DACS中，用聚苯乙烯珠偶联抗体标记的目标细胞同时受到粘性力和附加的DEP力控制，而未标记的细胞仅受到粘性力作用。最终，目标细胞从介电电极上移除并被收集。有研究者引入了一种磁激活细胞分选器，它使用磁珠标记目标细胞，类似于DACS中使用聚苯乙烯珠的方式。所有上述微流控技术都要求在分选前对目标细胞进行标记。有研究者提出了一种新颖的无标记微流控技术，该技术利用铁磁流体动力学。磁场驱动磁性纳米颗粒朝向电极，从而迫使非磁性细胞远离电极。细胞的速度取决于细胞大小，因此可以在不同位置分离和收集细胞。
图3. 基于塞子的微流控方法示意图。载液从两侧剪切样品流，形成包含单个细胞的独立液滴。
微流控方法可以与分隔技术相结合，有效地将单细胞隔离到小隔室中。这些隔室包括液滴、微孔/微化恒器和生长室。例如，有研究者报道了一种新颖的基于塞子的微流控方法，用于从其群体中分离细胞（图3）。在该系统中，载液的压力从相反方向剪切样品液成为单个液滴，随机地将单细胞封装并隔离到液滴中。与连续稀释法的随机性相似，每个液滴中的细胞数可以通过泊松分布公式进行估算。
2.5. 显微操作法
显微操作是获取单细胞的另一种潜在方法。通常，有两种类型的显微操作方法：机械式和光学式。最简单的机械显微操作是使用显微操作器，例如玻璃毛细管，借助注射泵的力量来捕获单细胞。机械显微操作也可以使用其他机制，如气动阀、流体动力镊子和声波镊子。对于光学显微操作，光镊利用聚焦光源（如激光）产生的辐射压力来捕获和操纵单个细胞。为了减少对细胞的潜在光损伤，通常使用高度聚焦的近红外激光。细胞受到两种类型的力：散射力和梯度力，它们作用于不同方向。此外，一旦这些力相互抵消，细胞就可以被保持在捕获中心（图4）。光学操作无物理接触，因此可以在无菌条件下的封闭腔室中捕获细胞。光学操作过程产生的热量可能会损伤细胞。显微操作技术在单细胞分离方面显示出最高的精度。然而，低通量分析和较高的操作技能限制了它们在基于个体细胞的研究中的广泛应用。
图 4. 器件内微培养系统的基本内部结构（Wakamoto 等，2001）。流体介质通过半透膜进行交换。当分析腔室中的目标细胞分裂后，光学镊子可捕获其中一个子细胞并将其移至废液（培养）腔室中。