摘要
目的 基于水疱性口炎病毒构建东部马脑炎病毒包膜蛋白的重组病毒。方法 通过将EEEV包膜蛋白基因 E3E2E1 及 EGFP 报告基因插入复制型VSV-ΔG骨架，构建重组质粒 pVSV-ΔG-EEEV-E3E2E1-EGFP，将其与辅助质粒共转染含有 T7 RNA 聚合酶基因的痘病毒感染BHK-21细胞，细胞上清连续传代后通过空斑法获得单一病毒rVSV-ΔG-EEEV-E3E2E1-EGFP；利用Western blot和透射电镜鉴定该重组病毒；通过高通量细胞成像系统观察rVSV-ΔG-EEEV-E3E2E1-EGFP在不同时间点的增殖动力学变化。结果 成功构建了pVSV-ΔG-EEEV-E3E2E1-EGFP，获得了单一纯化的重组病毒 rVSV-ΔG-EEEV-E3E2E1-EGFP ；蛋白印迹和免疫荧光试验显示该病毒感染细胞后能够正确表达病毒蛋白；透射电镜观察重组病毒形态呈典型的子弹状；通过Bioscreen C生长曲线分析仪实时监测显示，重组病毒 rVSV-ΔG-EEEV-E3E2E1-EGFP的增殖动力学与 VSV-EGFP 基本一致；高通量细胞成像实验显示重组病毒感染细胞之后荧光强度变化呈现显著的MOI依赖性。结论 本研究制备的rVSV-ΔG-EEEV-E3E2E1-EGFP能正确表达EEEV包膜蛋白并保持良好增殖活性，为EEEV中和抗体评价及感染机制研究提供了基础。
东部马脑炎病毒是披膜病毒科的甲病毒属成员之一，主要由黑尾脉毛蚊传播。EEEV感染造成的东部马脑炎为人兽共患传染病，可造成人类急性脑炎，病死率可达30%，幸存者常伴有严重后遗症。EEEV可通过气溶胶传播且具有高度的传染性，也被国际社会列为防生物恐怖的主要种类之一，我国将其列为第一类病原微生物。到目前为止，EEEV主要流行于美国东部以及中美和南美的一些国家和地区。1991年，李其平等从新疆全沟硬蜱中分离到1株 EEEV。陈立等对我国13个地区进行人血清抗体检测，抗体阳性的有78例，阳性率高达15%。有研究显示2002 年我国福建省在200 余例疑似脑炎患者检测中，发现 15例感染者血清为EEEV阳性。随后关于 EEEV 感染阳性我国再未见报道。但近年来，随着全球化一体化进程加速和气候变暖的影响， EEEV有可能跨地区传播风险加大。目前尚无被批准用于普通人群预防的EEEV疫苗。因此，加强对EEEV的防控基础研究具有十分重要的意义。
EEEV 是基因组为11 000 nt左右的单股正链 RNA 分子。EEEV病毒颗粒呈球形，直径约60~70 nm。由于EEEV属于生物危害程度第一类病毒，其活毒相关操作必须在生物安全三级实验室中进行，相关研究受到一定限制。近年来，假病毒具有可操作性强、生物风险低等优势，在EEEV假病毒方面，已经报道的有基于鼠白血病病毒基因组的假病毒系统、基于辛德毕斯病毒的病毒复制子颗粒系统等，广泛应用于病毒入胞、抗体中和活性评价等方面。
水疱性口炎病毒是单股负链RNA 病毒，属于弹状病毒科，口蹄疫病毒属，其基因组大小为11 000 nt。VSV在人类中通常不会或者引起轻度病变，可在生物安全二级实验室操作。VSV能够允许灵活整合异源病毒包膜蛋白，并能快速复制至高滴度。目前，以VSV作为重组病毒载体被广泛应用于中和抗体评价、疫苗研究等，具有很好的安全性、高滴度等优势。VSV重组病毒以目的病毒的包膜蛋白代替VSV的包膜糖蛋白，使其在免疫测定中能够被目的病毒诱导产生的抗体有效识别，降低了目的病毒的毒性确保了操作的安全性。例如，针对马尔堡病毒、裂谷热病毒、狂犬病毒等的rVSV重组病毒均被证实是进行抗体中和实验的合适诊断替代病毒。近年来，rVSV-SARS-CoV-2重组病毒也被广泛应用于中和抗体的评价和新冠病毒疫苗研发中，其检测结果与野毒株具有很好的一致性。本研究旨在利用VSV重组病毒载体，通过反向遗传学技术拯救EEEV E3E2E1的重组VSV病毒，以此替代EEEV野生毒株降低其研究的生物安全风险，为实现抗体活性评价和疫苗评价提供实验材料。
1 材料与方法
1.1 质粒、病毒及细胞
BHK-21细胞为本实验室保存， pVSV-ΔG-EGFP 空载由本实验室制备保存。辅助质粒pBlueScript-N、pBS-P、pBS-G、pBS-L及含有T7 RNA聚合酶的痘病毒毒株均由武汉病毒所惠赠； 大肠埃希菌感受态DH5α购自上海唯地生物技术有限公司。目的基因及引物序列由擎科生物科技有限公司合成。
1.2 主要仪器及试剂
BIO-TEK 质粒大提试剂盒购自安诺论生物科技有限公司；小鼠抗EEEV-E2多克隆抗体由实验室制备储存；小鼠抗EEEV单克隆抗体1G2由实验室制备；2 × KeyPo Master Mix酶购自Vazyme公司；DL DNA 5000 Marker购自日本Takara公司；DMEM培养基购自美国Corning公司；胎牛血清和磷酸盐溶液购自HyClone公司；脂质体转染试剂、异硫氰酸荧光素标记的山羊抗小鼠 IgG、花菁素荧光染料标记的山羊抗小鼠IgG均购自生工生物工程有限公司；IRDye® 680CW Goat Anti-Mouse IgG 购自Abcam 有限公司。
1.3 方法
1.3.1 EEEV-E3E2E1编码基因及扩增引物的设计与合成
根据EEEV 76V-25343株基因序列，合成目的基因2 946 bp，用SnapGene软件设计上游引物为5'- GCCTTTTTATGCATGAGCCTGGCCACCGTGATGTGCGTG-3'，下游引物为5'- CTCTATGTCGTACCGTTAGTGGCGGTGGAAGAACAGCAC-3'。将目的基因及引物序列送擎科生物科技有限公司合成。
1.3.2 EEEV-E3E2E1基因的PCR扩增
以合成的目的基因为模板，利用设计的引物及Prime STAR MAX聚合酶50 μL扩增体系进行扩增。扩增体系如下：引物各1 μL，模板1 μL，酶25 μL，ddH₂O 22 μL；PCR 扩增程序为：预变性：98 ℃ 2 min，1个循环数；变性：98 ℃ 10 s、退火：57 ℃ 5 s、延伸：72 ℃ 30 s，30个循环数；终延伸：72 ℃ 5 min，1个循环数。目的基因扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收。
1.3.3 pVSV-ΔG-EEEV-E3E2E1-EGFP质粒的构建
将pVSV-ΔG-EGFP载体通过EcoR I单酶切，回收的扩增产物与单酶切的载体进行连接，并转化至DH5α感受态，挑取单菌落于37 ℃摇床中扩增培养，提取少量质粒送擎科生物科技有限公司测序，正确的质粒命名为：pVSV-ΔG-EEEV-E3E2E1-EGFP。
1.3.4 rVSV-ΔG-EEEV-E3E2E1-EGFP 的拯救
先将BHK-21细胞感染含有T7 RNA聚合酶基因的痘病毒24 h，随后将pVSV-ΔG-EEEV-E3E2E1-EGFP与辅助质粒pBlueScript-N、pBS-P、pBS-G、pBS-L， 分别以1.25 μg、0.75 μg、1.25 μg、2.00 μg、0.25 μg的质量通过脂质体转染试剂共同转染到BHK-21细胞中，48 h后收获细胞上清，3 000 × g 离心去除细胞碎片，用0.22 μm滤器过滤去除痘病毒，并在培养基中添加 75 μg/mL的阿糖胞苷进一步抑制痘病毒的生长。
1.3.5 rVSV-ΔG-EEEV-E3E2E1-EGFP单斑挑取
将rVSV-ΔG-EEEV-E3E2E1-EGFP传至P3代并按照10倍比梯度稀释后分别感染6孔板中BHK-21细胞进行空斑实验，2 h后弃掉上清并加入2%甲基纤维素覆盖液，培养2 d后在荧光显微镜下对带有绿色荧光的斑点进行标记，用枪头将其挑出感染新铺满的24孔板BHK-21细胞，培养48h后进行免疫荧光鉴定。
1.3.6 rVSV-ΔG-EEEV-E3E2E1-EGFP的免疫荧光鉴定
将rVSV-ΔG-EEEV-E3E2E1-EGFP感染的BHK-21细胞进行E3E2E1蛋白表达的免疫荧光鉴定，识别E3E2E1蛋白的一抗为本室保存的1G2。
1.3.7 rVSV-ΔG-EEEV-E3E2E1-EGFP重组病毒纯化及Western-blot鉴定
将收获的rVSV-ΔG-EEEV-E3E2E1-EGFP上清利用20%蔗糖垫子通过超速离心的方法进行粗纯。粗纯的病毒进行SDS-PAGE后转膜，利用本室自制的小鼠抗EEEV-E2多克隆抗体进行Western-blot鉴定。
1.3.8 空斑形成实验滴定rVSV-ΔG-EEEV-E3E2 E1-EGFP
将BHK-21细胞2 × 10⁶个平均铺至6孔板每个孔中，24 h后，随后取病毒原液10 μL用DPBS稀释至 10⁻²、10⁻³、10⁻⁴、10⁻⁵、10⁻⁶、10⁻⁷梯度每毫升加至6孔板中感染，2 h后换2%甲基纤维素覆盖液；48 h后经过冲洗、固定以及结晶紫染色，最后进行斑点计数获得病毒滴度。
1.3.9 rVSV-ΔG-EEEV-E3E2E1-EGFP的生长曲线绘制
将BHK-21细胞以每孔1×10⁴个细胞的密度接种于Bioscreen C专用的100孔蜂窝板中，每孔体积为150 μL DMEM培养基。培养过夜后，分别以MOI=0.001的rVSV-ΔG-EEEV-E3E2E1-EGFP和VSV-EGFP病毒感染细胞，每组设置3个复孔。感染后立即将蜂窝板置于Bioscreen C生长曲线分析仪中，设定温度为37°C，连续培养96小时。仪器每隔1小时自动读取每孔的OD₄₉₀ nm值，以未感染病毒的细胞孔作为空白对照。实验结束后，导出数据，以时间为横坐标、OD₄₉₀ nm值为纵坐标，绘制两种病毒的实时生长曲线。
1.3.10 rVSV-ΔG-EEEV-E3E2E1-EGFP的透射电子显微镜观察
以MOI=0.001 VSV-ΔG-EEEV-E3E2E1-EGFP感染6孔板3个孔中的BHK-21细胞，24 h后细胞病变变圆；随后将细胞消化下来并1 000 × g ， 离心5 min。用PBS清洗两遍后，加入1 mL 的戊二醛固定24 h。最后，通过经超薄切片制样后并进行透射电子显微镜观察。
1.3.11 rVSV-ΔG-EEEV-E3E2E1-EGFP感染细胞后荧光强度的动态变化检测
将BHK-21细胞分别以1 × 10⁵个平均铺至96孔板中，分别以MOI=1、0.1、0.01和0.001感染细胞，2 h后换2%甲基纤维素覆盖液。利用BioTek 公司高通量细胞成像系统，设置6、12、18、24、30、36、42、48 h连续拍照并使用Gene5软件处理数据。