菌株分离鉴定：参考国标GB 4789.30-2016方法进行分离培养。样品经LB1增菌（30℃,22-26h），转接LB2增菌（30℃,22-26h）。取增菌液划线接种于PALCAM培养基和LM显色培养基上（37℃,24-48h）。挑取可疑菌落接种TSB培养基过夜培养后，提取DNA。以DNA为模板，先用李斯特菌属通用引物Prs进行PCR扩增（预期片段370bp），再将PCR阳性产物用LM特异性引物Lom2234进行PCR扩增（预期片段420bp），经琼脂糖凝胶电泳鉴定确认LM。ATCC19115作为阳性对照，ddH2O作为阴性对照。引物序列详见表2。
血清型鉴定：使用日本生物研究所的LM诊断血清试剂盒鉴定分离株血清型。O抗原鉴定：细菌悬液热处理后与相应血清在载玻片上反应观察凝集。H抗原鉴定：使用克雷基氏试管法筛选运动性强的菌株，其福尔马林灭活液与相应血清在试管中于51℃水浴1h后观察凝集。根据阳性结果判定血清型。
多位点序列分型（MLST）：根据巴斯德研究所网站（网址略）提供的7个管家基因（abcZ,bglA,cat,dapE,dat,ldh,lhkA）设计引物（引物序列详见表3）。提取分离株DNA作为模板进行PCR扩增。PCR产物测序，测序结果在巴斯德研究所MLST数据库中进行比对以确定菌株序列型（ST）和克隆群（CC）。
细菌生长曲线测定：从不同来源、血清型及ST型的LM分离株中选取25株，及参考株ATCC19115进行测定。将过夜培养的菌液OD600nm值调节为0.2，转接于新鲜BHI培养基中，37℃摇床培养。从3h开始每小时测定菌液OD600nm值，绘制生长曲线。每组3个重复。
微孔板测定细菌生物被膜形成能力：选取25株LM分离株及参考株ATCC19115进行测定。将过夜培养的菌液浓度调节至OD600nm值为0.2，再稀释100倍加入96孔细胞板（200μL/孔），每株菌6个重复，阴性对照为BHI培养基。37℃静置培养48h。弃去培养物，PBS清洗3次去除浮游菌。200μL甲醇固定20min，干燥后200μL结晶紫染色10min，蒸馏水清洗干燥，200μL 90%酒精脱色10min，测定OD595nm值。
屠宰场消毒剂对分离菌株的最小抑菌浓度（MIC）测定：选取25株LM分离株及参考株ATCC19115进行测定。将过夜培养的菌液浓度调整至OD600nm值为1.0，再用BHI培养基稀释1000倍备用。选用0.2%甲醛溶液、0.2%苯扎溴铵、0.5%碘溶液和2%氢氧化钠4种消毒剂。将消毒剂在Eppendorf管中用蒸馏水连续2倍比稀释。不同稀释度的消毒剂（100μL/孔）与稀释菌液（100μL/孔）加入96孔板混匀。37℃培养20-24h后测定OD600nm值。MIC定义为完全抑制细菌生长的最低药物浓度。
结果
单增李斯特菌PCR鉴定：所有分离株均经Prs引物扩增得到约370bp片段（图1A），Lom2234引物扩增得到约420bp片段（图1B），确认为LM。
菌株检出情况：从1239份样品中共分离出LM 58株，总检出率为4.68%。地区分布：天水市检出13株（9.85%），定西市检出38株（8.90%），庆阳市检出6株（3.75%），甘南检出1株（1.20%），白银市和平凉市未检出。动物种类来源：猪样品检出26株（3.68%），牛样品检出12株（7.05%），羊样品检出9株（6.28%），鸡样品检出8株（4.28%）。样品类型来源：胴体样品检出14株（7.33%），器具环境样品检出40株（4.80%），污水样品检出4株（3.48%）。菌株编号依据来源地（定西：DX2023LM01-38；庆阳：QY2023LM01-06；天水：TS2023LM01-13；甘南：GN2023LM01）。
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