2常见抑制因子对Anammox菌脱氮性能的影响及其作用机制
通过工艺运行参数的优化可以为微生物创造适宜的生长环境，但运行参数的优化只是为富集Anammox菌提供了必要的环境基础，厌氧氨氧化（Anammox）工艺的长期稳定运行仍然受到不可控因素（如盐抑制及有毒物质）的影响。常规有机物、盐浓度和重金属离子通常会对Anammox系统的稳定运行产生不利影响。
2.1常规有机物
在城市生活污水中COD一般在180~500 mg/L范围内，其中可生物降解的COD占污水中总COD的30%~50%，但在高氨氮工业废水中COD通常高达500~1 800 mg/L（即C/N=0.5~3）。废水中含有不同种类和浓度的有机物，通常被认为会对Anammox菌产生负面影响。研究指出高浓度的有机物降低了Anammox菌的竞争优势，污泥胞外聚合物的产量明显降低，导致Anammox污泥的容积指数升高和沉降性能变差。近年来，研究人员围绕外源有机物对Anammox系统脱氮性能的影响开展了广泛的研究，研究指出低质量浓度（<50 mg/L COD）的有机物可以促使Anammox菌和异养反硝化细菌之间形成稳定的协同作用，并不会导致反应器脱氮性能出现明显的降低。此外，醇类、醛类和酚类等毒害有机物也可以对Anammox菌产生抑制作用，其中酚类有机物的抑制作用是可逆的，而醇类有机物的毒性较强，且大多数抑制是不可逆的。研究表明Anammox菌体内的羟胺氧化还原酶可以氧化甲醇生成甲醛，而甲醛可以通过与多肽的不可逆交联引起蛋白质的损伤，从而导致Anammox菌活性降低。含酚废水中主要包含苯酚、硝基苯酚和氯酚等毒害污染物。研究表明苯酚质量浓度为404 mg/L时，Ca.Kuenenia stuttgartiensis的活性在18 h内下降了56%，而随着反应时间的延长（7 d），其活性仅下降了26%，而且去除反应体系中的苯酚后该类抑制情况可以得到明显缓解。研究指出进入Anammox菌体内的苯酚可以和联氨合成酶的α和γ亚基结合，且其可以竞争血红素的活性位点，导致血红素部分失活，阻断了Anammox菌体内联氨的合成反应，从而抑制了Anammox菌的代谢活性。此外，如果培养系统中长期存在苯酚，则苯酚将会逐渐渗透至细胞表面，在跨膜氨转运结构之间形成氢键、疏水相互作用力和π-π键的叠加力，干扰NH4+的转运，进而影响Anammox菌的活性。
Anammox菌最初被认为是专性化能自养微生物，但研究证实Anammox菌能够通过异化硝酸盐还原为氨（DNRA）途径进行混合营养生长。Ca.Loosdrechtia aerotolerans的基因组中编码了铁氧化还原蛋白依赖型的硝酸盐还原酶（NarB），其存在于多种微生物体内，被认为是参与硝酸盐还原的关键酶。NarB的存在可使Ca.Loosdrechtia aerotolerans有能力利用环境中的硝酸盐作为电子受体氧化小分子有机物，使其在富含硝酸盐的环境中获得竞争优势。与此同时，Anammox菌除了化能自养外，还有一种可选择的营养方式，即有机营养型。研究报道Ca.Jettenia asiatica能够代谢乙酸和丙酸，并且生长效率比无机底物培养的生长效率高出10倍。此外，Ca.Loosdrechtia aerotolerans的基因组中也构建出完整的丙酸盐代谢途径，从基因组层面证明了Anammox菌具有氧化小分子有机物的代谢潜能。在Anammox菌中，参与异化硝酸盐还原为氨途径的酶和氧化小分子有机物的代谢潜能表明Anammox菌在自然和工程生态系统中的生态位比传统认知更为广泛。与此同时，在实际废水处理过程中高浓度的有机物不可避免地会对Anammox菌产生负面影响。近年来，有研究指出介体材料（如生物炭）可以有效缓解有机物对Anammox菌的抑制作用。
此外，内源有机物对Anammox菌群的影响也值得进一步探究，内源有机物主要来源于微生物的代谢活动，其主要的产生形式为胞外聚合物和可溶性微生物产物。胞外聚合物是Anammox颗粒污泥或生物膜的重要成分，影响着颗粒污泥或生物膜的传质效率、吸附能力、结构稳定性。可溶性微生物产物则主要介导了Anammox菌与共存微生物之间的互作代谢过程。在颗粒污泥或生物膜系统中Anammox菌的生长速率取决于孔隙水中基质的传质速率，胞外聚合物作为生物膜与液体环境之间潜在的离子传输通道，过多的胞外聚合物会占用基质的传输通道，不利于反应基质的高效传输。此外，反应器内较高的氮负荷也会导致颗粒污泥分泌过量的胞外聚合物，导致污泥的沉降性和颗粒的悬浮性降低，主要原因在于较高的胞外聚合物含量可能致使颗粒污泥传输氮气和基质的孔隙度降低。内源有机物的另一种主要形式为可溶性微生物产物，其由可生物降解的有机物（如多糖和蛋白质）、信号分子（如酰化高丝氨酸内酯类化合物）及次级代谢物（如维生素B12）组成。研究指出在缺乏外源有机物的情况下，可生物降解的可溶性微生物产物是发酵细菌和异养反硝化细菌的主要碳源，特别是氨基酸、维生素B12和酰化高丝氨酸内酯类化合物可能介导了Anammox菌和异养细菌之间的互营代谢过程。
2.2盐浓度
高氨氮工业废水通常具有高盐的水质特性，高盐度会破坏细胞壁和抑制酶活性，甚至导致细胞的裂解。与此同时，盐度的增加也会导致颗粒污泥尺寸和污泥聚集指数降低。污泥表面自由能分析结果表明，盐度降低了污泥的Zeta电位和疏水性，增加了污泥的排斥势垒，且随着盐度增加，胞外聚合物中表面亲水官能团增加，氢键比例降低，蛋白质二级疏水结构减少，不利于污泥的聚集。此外，盐度也是影响细菌活性的重要环境因素之一，不同类型的Anammox菌对盐度的耐受程度不同。Ca.Scalindua spp.只有在Na（Ⅰ）质量浓度高于0.046 g/L时才能进行Anammox反应，且基质消耗速率受到Na（Ⅰ）和K（Ⅰ）浓度的共同影响，而Ca.Kuenenia stuttgartiensis对盐度的耐受极限为3~11.7 g/L NaCl，但Ca.Brocadia sinica对盐度的耐受极限却高达30 g/L NaCl。面对废水中存在的复杂盐成分，除了盐度会导致渗透胁迫外，不同类型的盐对于Anammox菌的抑制也存在差别。研究报道NaCl、KCl对Anammox菌的半抑制质量浓度（IC50）分别为6.20 g/L和7.15 g/L。相较于NaCl，Anammox菌中亚硝酸盐还原酶和联氨合成酶更容易受到K（Ⅰ）的抑制而不是Na（Ⅰ）的抑制。
胞外聚合物作为细菌抵御环境干扰的第一道屏障，盐度的增加可能导致细菌胞外聚合物的产量及离子含量发生变化。高盐度（>15 g/L NaCl）可以刺激Anammox菌产生大量的胞外聚合物抵御盐胁迫，虽然酶活性更容易受到K（Ⅰ）的抑制，但Anammox菌往往通过大量泵入K（Ⅰ）至细胞内以防止离子梯度和细胞渗透压的增加。此外，Anammox菌经过长期驯化可以从低耐盐性物种转变为高耐盐性物种，其中通过合成或转运相容性物质或摄入盐分的方式是Anammox菌适应盐度变化的主要机制。研究表明酵母菌提取物可以提高Ca.Scalindua japonica的活性，其可以通过直接吸取酵母菌的渗透调节物质或渗透调节物质的前体物来维持细胞的渗透压平衡，而且Ca.Scalindua japonica还可以直接吸取胞外相容性物质或相容性物质的前体物，以节省合成或转运相容性物质消耗的能量，而Ca.Scalindua rubra则可以合成相容性物质或摄入盐分两种途径来适应盐度变化。面对盐胁迫下出现不断恶化的水质状况，除了微生物自身合成的相容性物质，一些溶解性外源添加物也能增强Anammox系统抵御不利环境的能力。研究报道35.14 mg/L甘氨酸甜菜碱（GB）和54.65 mg/L甘露醇（MA）均能缓解Anammox过程中的盐胁迫（20 g/L NaCl），添加GB和MA后13 d内系统的脱氮效率分别从40%恢复到80.9%和69.1%，且Anammox菌的相对丰度分别增加了7.1%和4.3%。此外，低浓度的溶解氧和Fe（Ⅲ）也被证实可以增强Anammox菌的关键酶合成，促进Anammox菌的能量代谢，减轻盐胁迫对Anammox菌的影响。
2.3重金属离子
重金属离子对Anammox菌的影响主要分为短期和长期毒性抑制，其中短期毒性抑制侧重于评价重金属离子的急性毒性，而长期毒性抑制则重点关注Anammox菌对重金属离子的环境适应性和恢复能力。对于短期毒性抑制而言，不同浓度的重金属离子对Anammox菌的影响具有显著差异。低浓度的重金属离子可以刺激Anammox菌分泌大量的胞外聚合物抵御胁迫，当Cu（Ⅱ）质量浓度为5 mg/L时，重金属离子倾向于与胞外聚合物中带负电荷的官能团结合，降低静电斥力，形成桥接效应，使得污泥处于致密状态，但当Cu（Ⅱ）质量浓度升高至10~50 mg/L时，重金属离子倾向于与蛋白质中的羧基结合，导致胞外聚合物中蛋白质的链状结构被破坏，使得污泥处于松散状态。高浓度的重金属离子通常会对Anammox系统产生更强的急性毒性抑制。研究表明高浓度的重金属离子通常可以从可溶性微生物产物转移至胞外聚合物，进而扩散至细胞膜表面。胞外聚合物中的蛋白质为金属离子提供了大量的结合位点和官能团（如甲基、氨基、羧基和羟基等）8，6。金属离子与蛋白质上的官能团结合后，经过非特异性浓度梯度扩散至细胞内，与细胞内的核酸和酶活性位点结合，从而破坏细胞的结构和功能。例如，扩散至细胞表面的Zn（Ⅱ）通常会刺激细胞产生活性氧等自由基，造成DNA损伤和脂质氧化分解，进而导致细胞膜的解离图2（a）。此外，Cu（Ⅱ）也可以刺激细胞生成羟基自由基，在氧化还原过程中产生氧化应激反应破坏细胞膜的结构。与此同时，Anammox菌群通常具有缓解重金属离子生物毒性的能力，Ca.Kuenenia stuttgartiensis可以通过基质降解、Zn（Ⅱ）外排、络合反应、蛋白质降解与合成、DNA修复以及信号传导等方式抵御胁迫。然而，Anammox菌在适应重金属离子的应激过程中，细胞产生的大部分能量被用于去除细胞内多余的金属离子，降低了用于Anammox反应的能量供应，从而导致反应器的脱氮性能下降。
图2重金属离子对Anammox菌的影响
对于长期毒性抑制而言，重金属离子对Anammox菌的影响通常超过20 d，其中Anammox菌的竞争优势降低，金属离子传输系统的抑制和胞外聚合物留存的过量重金属离子是导致Anammox系统持续中毒的主要原因。例如，在高浓度铜离子的冲击下，负责将Cu（Ⅱ）从Anammox菌细胞内泵送到细胞外的基因cusA的表达明显降低，使得Anammox菌细胞内Cu（Ⅱ）浓度进一步升高，导致Anammox系统出现长达50 d的抑制现象。此外，胞外聚合物吸附的重金属离子仍能持续向周围环境释放，从而长期抑制微生物的活性。废水中影响Anammox过程的重金属离子较多，其中包括Cu（Ⅱ）、Zn（Ⅱ）、Fe（Ⅲ）、Cd（Ⅱ）、Pb（Ⅱ）、Cr（Ⅲ）、Ni（Ⅱ）、Ag（Ⅰ）、Mn（Ⅱ）和Hg（Ⅱ）等，其中Hg（Ⅱ）和Cd（Ⅱ）对Anammox菌的毒性具有持久性，而Cu（Ⅱ）和Zn（Ⅱ）对Anammox菌的毒性具有可逆性。在重金属离子的胁迫下，可能促进负责物质迁移转化的功能基因表达增加，不仅可以将毒性较高的物质转化为低毒物质，还可以将细胞内过量的重金属离子排出体外，这种自我调节的解毒过程有助于Anammox系统恢复其生物活性。其中，As（Ⅲ）可以在微生物的作用下发生价态转换被氧化成低毒性的As（Ⅴ），降低了重金属离子的生物毒性。此外，Cr（Ⅳ）和Cr（Ⅵ）也能在微生物的作用下还原为Cr（Ⅲ），但在长期的Cr（Ⅵ）暴露下，细胞内富集的Cr（Ⅵ）将破坏酶的结构，阻断功能基因的表达，导致反应器的脱氮性能显著降低。与此同时，研究指出一些低浓度的重金属离子可以用于提高Anammox菌的活性。例如，Anammox菌可以利用Fe（Ⅲ）和Mn（Ⅱ）作为潜在的电子受体强化Anammox菌群的胞外电子传递过程，提高Anammox系统的脱氮性能。
重金属离子的毒性水平、系统的恢复时间及微生物的适应性可以用于判断重金属离子的毒性强弱图2（b）。其中，Hg（Ⅱ）、Cu（Ⅱ）、Zn（Ⅱ）、Cd（Ⅱ）被认为是高毒性的重金属离子，这些重金属离子通常可以直接或通过价态转变产生自由基，攻击细胞中的蛋白质和DNA，阻止微生物的电子转移，使Anammox菌难以对这些重金属离子产生抗性，并且在质量浓度为10 mg/L时即可抑制50%的Anammox活性，同时需要大约30 d的时间才能恢复活性。此外，Fe（Ⅲ）、Mn（Ⅱ）、Ni（Ⅱ）和Ag（Ⅰ）被认为是中毒性的重金属离子。相较于高毒性的重金属离子，Fe（Ⅲ）、Mn（Ⅱ）、Ni（Ⅱ）和Ag（Ⅰ）对Anammox菌的抑制作用较小，可以在15 d左右恢复活性。Pb（Ⅱ）、Mo（Ⅳ）和As（Ⅲ）对Anammox菌的毒性较弱，被认为是低毒性的重金属离子。值得注意的是，一些重金属离子通常以沉淀的形式存在于Anammox系统中，因此其实际毒性可能明显低于理论结果。例如，Pb（Ⅱ）对Anammox菌毒性较弱的原因可能与其在环境介质中的溶解度较低有关。在Anammox菌的培养驯化过程中通常利用碳酸氢盐调控废水的碱度，这导致Pb（Ⅱ）往往以沉淀的形式存在于反应体系。研究表明即使在Anammox反应器内添加了40 mg/L的Pb（Ⅱ），但其液体离子质量浓度仅为2.3 mg/L，这极大地限制了Pb（Ⅱ）在Anammox系统的毒性作用。为了缓解重金属及其离子对Anammox菌的抑制，研究人员采用多种手段调控提升Anammox菌抵抗不利环境的能力图2（a）。例如，严格控制微生物周围环境的pH，减少重金属离子与Anammox菌表面的弱酸性有机官能团结合；调控重金属离子与环境中的有机物或无机物络合沉淀，并以微溶金属盐的形式析出；利用低强度超声结合EDTA清洗，提高Anammox菌对重金属离子的抵抗能力；驯化具有较高生物量的颗粒污泥或生物膜，增强Anammox菌对重金属离子的抗性。
3总结和展望
面对废水中复杂的水质特性和污染物种类，pH对微生物生长和代谢的直接影响以及pH变化带来的游离氨和游离亚硝酸盐的毒性抑制不容忽视，而针对低温对Anammox菌活性的抑制，冷休克蛋白可以在一定程度上消除低温对Anammox菌的负面影响。此外，Anammox菌是耐氧菌而不是严格的厌氧菌，不同的Anammox菌具有多种策略耐受自然和工程生态系统中的氧气，颗粒污泥或生物膜形式的载体有利于避免Anammox菌受到溶解氧的抑制。低浓度的外源有机物有助于Anammox菌与异养菌形成稳定的协同作用，且Anammox菌除了化能自养外，其还具有氧化小分子有机物的代谢潜能，微生物分泌的外源有机物可以介导Anammox菌和异养细菌之间的互营代谢过程。对于废水中存在的盐胁迫，Anammox菌合成或转运相容性物质或摄入盐分是其适应盐度变化的主要机制，低浓度的溶解氧和Fe（Ⅲ）也可以缓解盐胁迫对Anammox菌的影响。根据重金属离子对Anammox菌的毒性，Hg（Ⅱ）、Cu（Ⅱ）、Zn（Ⅱ）、Cd（Ⅱ）被认为是高毒性的重金属离子，Fe（Ⅲ）、Mn（Ⅱ）、Ni（Ⅱ）和Ag（Ⅰ）被认为是中毒性的重金属离子，而Pb（Ⅱ）、Mo（Ⅳ）和As（Ⅲ）则被认为是低毒性的金属离子。作为一种低碳的新型废水生物脱氮工艺，Anammox具有较强的应用潜力，目前的研究已经深入探讨了各种抑制因子的作用机制，但在实验室条件下的毒性评价方法具有局限性，未来可从以下方面深入研究：1）从细胞结构水平探究Anammox菌的中毒机制及生物适应性，评价多种抑制因子共存的毒性抑制效果，建立适合工程应用的毒性评价方法；2）开展不同类型实际废水抑制因子对Anammox菌的短期、长期及复合影响。