3.5. 生物反应器中粗甘油SCO的放大生产
结果表明，来自肥皂生产的粗甘油（G1）是解脂耶氏酵母A101脂质合成的最佳碳源。然而，我们注意到较高的生物量产量与较高的脂质含量不相关（图3）。这可能是由于实验条件不受控制造成的，因为在摇瓶实验中难以准确控制pH或溶解氧等工艺参数。因此，采用5 L发酵罐使用G1作为碳源进行放大发酵，以更好地评估所选废产品生产脂肪酸的潜力。在此，研究了两种摩尔碳氮比对生物反应器中脂质合成的影响。
有趣的是，我们观察到C/N比对生物量生产的影响比在摇瓶实验中更大（图4）。在生物反应器中，C/N摩尔比为75时，最大生物量产量在72小时后获得。达到34.65±0.35 g·L⁻¹，但在C/N 100时，最高生物量产量在48小时后检测到，为27±3.25 g·L⁻¹。如图4所示，解脂耶氏酵母A101菌株在发酵72小时内消耗了大部分可用甘油。值得注意的是，在另一项针对葡萄糖上解脂耶氏酵母的研究中，生物量在125小时的培养期间达到了21.6 g·L⁻¹。此外，在该研究中使用了酵母提取物补充。在Candida freyschussii的脂质生产研究中也使用了相同的补充，其中甘油是碳源。因此可以得出结论，来自脂肪皂化的粗甘油为解脂耶氏酵母的高效生长提供了必需化合物。因此，生产成本可能会降低，因为这种底物不需要酵母提取物补充。
图4和表4展示了分批发酵中两种C/N摩尔比的脂质合成和工艺参数的比较。与先前的实验一致，在C/N 100时获得了更高的脂质滴度。这可能是因为培养基中氮的减少促进了脂质积累。引人注目的是，在C/N 75的过程中，只有3.36 g·L⁻¹的生物量转化为脂质，占细胞干重（CDW）的12.54%。相反，在较低的氮浓度（C/N 100）下，脂质含量达到了CDW的20%，这是野生型菌株从头合成脂质所报道的最高脂质滴度之一。据报道，野生型解脂耶氏酵母可以产生高达其细胞干重50%的脂质，但这是通过脂肪酸补充实现的。然而，据报道解脂耶氏酵母MUCL 28849菌株能够产生高达生物量38%的脂质，但在该研究中，该过程在较小的规模和较低的C/N比下进行。在之前的报告中，在类似的生物反应器条件下（C/N 100），野生型解脂耶氏酵母的脂质积累仅为11.7% CDW。代谢工程可以提高产物滴度和产量，基因修饰的高脂质生产菌株可以增加脂质产量但降低细胞生长。
有趣的是，大部分碳转化为柠檬酸（CA），在过程结束时分别产生42.6 g·L⁻¹和55.85 g·L⁻¹（C/N 75和C/N 100）。据报道，在解脂耶氏酵母的脂质合成过程中存在三种不同类型的代谢。第一种，典型的SCO在氮耗尽后发生。第二种，非典型的"产油"特征，其中脂质被储存，但之后开始降解并产生柠檬酸。第三种，非典型的"产油"特征，其中脂质同时在酵母细胞内积累，柠檬酸被分泌到培养基中，而细胞脂质不发生降解。因此，高柠檬酸含量是由非典型的产油代谢引起的，正如之前在解脂耶氏酵母中观察到的那样。这个问题可以通过基因操作和将碳通量从柠檬酸生产转向脂质合成来解决。
尽管如此，在受控条件下脂质产量得到了提高。最终脂质产量为4.25 g·L⁻¹，与摇瓶实验在C/N 100时相比，脂质积累增加了2.8倍。
图4. C/N 75（A）和C/N 100（B）的分批生物反应器发酵。粗甘油G1用作碳源。甘油（◆）、生物量（○）、脂质（■）和柠檬酸（▲）的时间曲线。显示了重复发酵的数据。误差棒代表标准偏差。
3.6. 脂肪酸组成
有趣的是，最初野生型解脂耶氏酵母被认为只有在脂肪酸材料用作底物时才能储存大量脂质。此外，解脂耶氏酵母菌株被认为是完美的细胞工厂，只有在脂肪酸材料上生长时才能生产高附加值的"定制"脂质，如可可脂替代品或illipé替代品。解脂耶氏酵母A101在各种粗甘油批次上培养的生物量中的脂肪酸谱因所应用的底物类型而异。对于每种粗甘油批次的两种C/N比，变化不显著。表5展示了含有不同C/N比的粗甘油和纯甘油的限定培养基中脂肪酸组成的比较。在解脂耶氏酵母生物量中检测到的主要脂肪酸是油酸（C18:1）。它占脂肪酸池的44%~55%。此外，棕榈酸（C16:0）和亚油酸（C18:2）在细胞中也检测到高含量（10%~20%）。这些结果与之前的报告一致。然而，在本研究中，解脂耶氏酵母A101产生更多的亚油酸（11%~20%）和更少的硬脂酸（<10%）。在C/N 100时，我们观察到油酸含量略低，亚油酸合成更高。值得注意的是，在粗甘油G3上生长的解脂耶氏酵母A101积累了最高含量的多不饱和脂肪酸（PUFAs）——在C/N 75和C/N 100时分别达到总脂肪酸池的20%和18.7%。相反，在C/N 75时在G1粗甘油上生长的解脂耶氏酵母A101生物量中检测到最低的PUFA含量（10%）。此外，脂肪酸谱在放大过程中保持相似（表4）。同样，油酸在生物量中含量最高，但相对减少（44%）。此外，观察到亚油酸和棕榈油酸富集。在放大过程中亚油酸产量显著增加，正如之前观察到的那样。
尽管脂肪酸谱发生变化，但在肥皂生产衍生的粗甘油（G1）上培养的解脂耶氏酵母生物量中，饱和脂肪酸（SFAs）和单不饱和脂肪酸（MUFAs）的浓度占总脂质池的74%。这在脂肪酸组成方面对潜在的生物柴油生产具有显著优势，因为多不饱和脂肪酸酯具有低熔点、低十六烷值和降低的氧化稳定性——这对柴油燃料来说是不理想的。这一有趣的结果表明，每批粗甘油可能显示出特定的脂肪酸组成（表5）。迄今为止，只有基因工程提供了修改脂肪酸含量的可能性。因此，这项研究为解脂耶氏酵母的脂肪酸生产提供了新的见解。从技术角度来看，使用一种野生型菌株仅通过修改碳源来生产生物柴油或富含PUFA的膳食补充剂要容易得多。这是因为如前所述，基因修饰菌株的稳定性和生长较差。换句话说，野生型菌株可能是高效的脂质生产者。此外，工程化解脂耶氏酵母菌株可以在具有已建立最佳碳源的过程中使用，从而提高修饰菌株的性能。总之，基于肥皂生产衍生的粗甘油的单细胞生产与工程化脂质代谢相结合，可以在低成本和高效的脂肪酸从头合成方面取得突破性进展。
表4 在生物反应器中，解脂耶氏酵母A101在不同碳/氮比的含粗甘油G1培养基中生长的脂质含量脂肪酸谱（%）以及分批发酵过程中的工艺参数。
| 脂肪酸 | C/N 75 | C/N 100 |
|---|---|---|
| 16:0 | 9.04±0.4 | 11.21±0.06 |
| 16:1 | 8.31±0.4 | 8.79±0.41 |
| 17:1 | 0.95±0.12 | 1.82±0.07 |
| 18:0 | 6.10±0.14 | 7.21±0.17 |
| 18:1 | 44.44±0.19 | 43.97±0.39 |
| 18:2 | 23.59±1.38 | 24.71±0.81 |
| 18:3 | 1.09±0.46 | ND |
| 20:0 | 0.39±0.02 | 0.29±0.01 |
| 22:0 | 0.56±0.02 | 0.29±0.01 |
| 22:6 | 1.13±0.02 | ND |
| 24:0 | 0.16±0.01 | 1.24±0.01 |
| 其他 | 4.2 | 1.35 |
| SFAs | 16.25 | 20.24 |
| MUFAs | 53.70 | 53.71 |
| PUFAs | 25.81 | 24.70 |
| YX/S（g·g⁻¹） | 0.210 | 0.166 |
| YL/X（g·g⁻¹） | 0.126 | 0.200 |
| YL/S（g·g⁻¹） | 0.026 | 0.031 |
| YCA（g·g⁻¹） | 0.284 | 0.372 |
YX/S——生物量产量；YL/X——来自生物量的脂质产量；YL/S——脂质产量；YCA——柠檬酸产量。ND——未检测到。
| 粗甘油 | C16:0 | C16:1 | C18:0 | C18:1 | C18:2 | 其他 | SFAs | MUFAs | PUFAs |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| C/N 75 | |||||||||
| G1 | 14.26±0.37 | 4.69±0.13 | 9.73±0.23 | 54.83±1.26 | 10.84±1.05 | 5.64 | 24.00 | 59.52 | 10.84 |
| G2 | 17.95±0.12 | 6.02±0.06 | 8.11±0.25 | 46.30±0.47 | 15.72±0.10 | 5.88 | 26.07 | 52.33 | 15.72 |
| G3 | 12.27±0.27 | 3.74±0.11 | 5.72±0.36 | 47.54±2.04 | 20.06±0.31 | 10.67 | 17.99 | 51.28 | 20.06 |
| G4 | 19.13±0.31 | 6.35±0.03 | 7.44±0.06 | 47.39±0.79 | 13.63±0.71 | 6.07 | 26.56 | 53.74 | 13.63 |
| G5 | 12.91±0.27 | 4.70±0.11 | 6.99±0.36 | 47.02±2.04 | 14.43±0.31 | 13.95 | 19.90 | 51.72 | 14.43 |
| G6 | 19.91±1.32 | 8.96±0.98 | 5.82±1.20 | 43.03±0.81 | 15.68±1.70 | 6.60 | 25.73 | 51.99 | 15.68 |
| C/N 100 | |||||||||
| G1 | 16.55±0.14 | 5.31±0.11 | 10.33±0.29 | 48.36±0.49 | 14.27±0.20 | 5.17 | 26.88 | 53.68 | 14.27 |
| G2 | 17.07±0.40 | 5.16±0.09 | 10.45±0.10 | 46.42±0.60 | 16.79±0.67 | 4.11 | 27.52 | 51.58 | 16.78 |
| G3 | 15.09±0.67 | 4.45±0.26 | 7.74±0.53 | 48.79±0.51 | 18.71±0.27 | 5.21 | 22.83 | 53.24 | 18.71 |
| G4 | 18.68±0.35 | 5.21±0.10 | 10.22±0.19 | 46.90±0.27 | 15.69±0.75 | 3.28 | 28.90 | 52.11 | 15.69 |
| G5 | 12.38±0.19 | 4.20±0.08 | 8.89±0.06 | 50.45±0.29 | 17.15±0.07 | 6.91 | 21.28 | 54.65 | 17.15 |
| G6 | 19.82±0.46 | 5.62±0.12 | 11.45±0.25 | 41.58±1.70 | 16.18±1.80 | 5.35 | 31.27 | 47.2 | 16.18 |
MUFAs：单不饱和脂肪酸；PUFAs：多不饱和脂肪酸；SFAs——饱和脂肪酸。
4. 结论
来自肥皂生产的粗甘油无需任何预先纯化即可通过解脂耶氏酵母生产单细胞油。此外，这种底物不需要酵母提取物补充，没有额外的生产成本。碳氮比的优化允许脂质积累高达细胞干重的25%。这是迄今为止解脂耶氏酵母生物量中从头合成所达到的最高脂质滴度之一。此外，通过确定特定的粗甘油作为唯一碳源，可以在解脂耶氏酵母生物量中显示出特定的脂肪酸组成。总之，本研究表明，低成本的废底物可以在不经过任何纯化的情况下直接转化为单细胞油——这是绿色化学的首要目标。
致谢
我们感谢Mateusz Marciniak在摇瓶实验中的技术支持。本工作由波兰科学与高等教育部资助——项目编号IP2012008972。