研究简介
本研究针对食品加工环境中单核细胞增生李斯特菌持久污染这一食品安全难题，聚焦其生物膜形成机制的适应性演化路径，首次采用实验进化策略探究该菌向强生物膜生产者演化的分子基础。研究人员以实验室参考株EGDe和高突变率食品分离株FBR16为祖先菌株，构建基于聚甲醛小珠的反复定植—生物膜形成—扩散循环体系，分别在4周和6周后成功筛选出强生物膜进化变异株。结晶紫染色结果显示，变异株的生物膜产量较祖先株提升3至7倍，且在培养早期即出现显著差异，而浮游生长曲线未见变化，表明表型改变源于附着能力而非增殖速率的提升。进一步分析发现，变异株在指数期和稳定期的细胞表面疏水性均显著升高，这是两株进化菌共有的关键特征。蛋白质组学分析揭示，定位于同一操纵子的Lmo1798（预测葡萄糖基转移酶）和Lmo1799（含226个丙氨酸—天冬氨酸串联重复及LPXTG细胞壁锚定基序的肽聚糖结合蛋白）在变异株中均显著上调，其中FBR16变异株的上调倍数超过200倍。基因组测序锁定EGDe变异株在上游非编码区存在单碱基插入，并在lmo1799基因内部发生42碱基框内缺失，导致串联重复数由226降至219，推测前者驱动了Lmo1799的高水平表达。为验证因果关系，研究者构建了启动子恢复株和lmo1799缺失株，结果显示二者生物膜形成能力和表面疏水性均回落至接近祖先株水平，证实上游插入突变与Lmo1799过表达的协同作用是强生物膜表型的核心机制。在不同材质表面的附着实验中，变异株在疏水性的塑料和不锈钢表面表现出更强的定植优势，而在亲水性玻璃表面无显著提升，提示Lmo1799通过影响细胞表面电荷与疏水性，调控了菌体对特定材质的附着偏好。本研究不仅揭示了李斯特菌在表面选择压力下经由Lmo1799过表达实现生物膜增效的演化路径，也为食品加工环境的生物污染防控提供了新的分子靶点。
Bioscreen 全自动生长曲线分析仪的应用
研究通过实验进化策略证实，单核细胞增生李斯特菌可在表面定植选择压力下演化为强生物膜生产者，其核心机制在于lmo1799的过表达及其介导的细胞表面疏水性提升。研究发现，经塑料小珠反复定植—生物膜形成—扩散循环筛选获得的EGDe和FBR16进化变异株，生物膜产量较祖先株提高3至7倍，且该差异在培养早期即显现，而浮游生长曲线与祖先株高度重合，表明表型增强源于附着能力而非增殖速率的改变。蛋白质组学分析显示，定位于同一操纵子的Lmo1798与Lmo1799在变异株中均显著上调，其中FBR16变异株的上调倍数超过200倍；基因组测序进一步锁定EGDe变异株在lmo1799上游非编码区存在单碱基插入，并在基因内部发生42碱基框内缺失，推测前者驱动了该操纵子的高水平转录。突变体验证实验明确，将上游启动子区域恢复为祖先株序列后，无论保留还是删除lmo1799，变异株的生物膜形成能力与表面疏水性均显著回落，证实上游插入突变与Lmo1799过表达的协同作用是强生物膜表型的关键成因。此外，变异株在疏水性塑料和不锈钢表面的附着优势明显，而在亲水性玻璃表面无显著提升，说明Lmo1799通过重塑细胞表面理化性质，调控了菌体对不同材质表面的附着偏好。综上，本研究首次揭示了李斯特菌经由Lmo1799过表达实现生物膜增效的演化路径，为理解该病原菌在食品加工环境中的持久污染机制及靶向防控提供了重要的分子依据。
实验结果
仅在有上皮细胞的选择压下，鲍曼不动杆菌迅速出现黏液型（mucoid）克隆——其菌落呈典型黏滑表型、荚膜染色可见更厚的外被，沉淀/黏度实验提示胞外多糖增多.同时这些进化克隆对多种抗菌药（尤其头孢类）耐药性显著升高，但对多黏菌素基本不变。全基因组重测序把关键变异锁定在少数基因上：ptk（荚膜/K‑locus相关激酶）出现错义突变（V653E）、rsmG（16S rRNA m⁷G甲基转移酶）出现功能缺失/移码类突变，以及（在A549共培养系中）rnaseI缺失突变。回补与回恢实验进一步证明ptk突变通过延长荚膜外多糖链、形成高分子量多糖并释放到上清，带来"更厚荚膜/更强黏液表型"，其代价是对上皮细胞的黏附下降、被巨噬细胞样细胞吞噬内化减少，并可刺激更强的IL‑6/IL‑8/TNF‑α转录上调。rsmG突变使16S rRNA在G524位点失去m⁷G修饰，导致核糖体翻译效率上调（体外翻译活性增强），并以全局方式改变对β‑内酰胺等的耐受/耐药表型。rnaseI缺失则通过改变外膜形态与通透性、提升RND外排泵相关基因mRNA稳定性与外排表达，协同推动耐药，并伴随铁获取相关基因（bau/bas系列）下调而间接影响头孢地尔（cefiderocol）敏感性。
图1、实验进化系统。用于分离强生物膜产生菌株的珠子基实验进化系统的示意图。
图2、AN和EV分离株在不同时间下的浮游生长及生物膜形成情况。A) EGDe（左）和FBR16（右）AN（灰色）及EV（黑色）分离株在30°C BHI培养基中的浮游生长曲线。数值为独立生物重复实验的平均值，阴影表示标准差（n = 3）。B) 在30°C下通过CV染色测定的EGDe（左）和FBR16（右）AN（灰色）及EV（黑色）分离株的生物膜形成过程。数值为独立生物重复实验的平均值，误差线表示最小值和最大值
图3、不同表面上测试菌株的生物膜形成能力。A) 滑片在孔内的位置示意图。B和C) 在30°C BHI培养基中孵育24小时后，附着于不同表面的情况。条形图表示EGDe菌株（B）和FBR16菌株（C）在AN（灰色）和EV（黑色）条件下侧壁和底部滑片的平均细胞计数。误差条对应生物重复实验的最小值和最大值。
图4、EGDe（左）和FBR16（右）细胞表面疏水性，AN（灰色）和EV（黑色）。误差条表示生物重复样本的标准差（n = 3）。AN与EV分离株之间的比较P值标注在误差条上方。
图5、EV菌株中表达的蛋白质与AN分离株中EGDe（左）和FBR16（右）的火山图。p值小于0.05且log10倍数变化大于1或小于-1的值被视为具有统计学显著性，分别以紫色和绿色标示上调和下调的蛋白质。所有具有统计学显著差异表达的蛋白质均显示其蛋白标识符。该实验进行了三次独立的生物学重复。
总结
生物膜形成是单核细胞增多性李斯特菌在食品加工环境中传播和持续存在的关键因素。为了进一步了解促进生物膜形成的机制，研究人员采用实验进化系统，分离出强生防能力的单核细胞增多性李斯特菌EGDe（参考菌株）和FBR16（高突变型食品分离株）。经过多次表面定殖、生物膜形成、扩散及附着于新表面的过程后，获得了进化变异株（EV株），发现其生物膜产量最高可达祖代株（AN株）的七倍。表型分析显示，EGDe和FBR16的EV株均表现出细胞表面疏水性的增强，这是两者共同的显著特征。蛋白质组学分析表明，与AN株相比，EV株中上调表达的蛋白质主要包括Lmo1798（一个预测的葡萄糖转移酶）和Lmo1799（一种含226个 Ala-Asp 串联重复序列的拟肽聚糖结合蛋白）。对EGDe EV株的基因组分析发现，在lmo1799的上游区域存在单核苷酸插入，以及lmo1799基因中42个核苷酸的错义缺失，这可能导致该基因高水平表达。一种含有219个丙氨酸-天冬氨酸重复序列的功能性蛋白。为了评估Lmo1799对单核细胞增多性李斯特菌（L. monocytogenes）胞外囊泡（EV）表型及整体生物膜形成能力的影响，构建了缺失lmo1799和/或上游插入片段的EGDe EV突变株。值得注意的是，这两个构建的突变株与EV菌株相比，均表现出生物膜形成能力降低以及表面疏水性减弱的现象，表明这些突变对强生物膜形成具有重要作用。总体而言，这些观察结果表明Lmo1799在L. monocytogenes细胞表面特征和生物膜形成中发挥着关键作用。
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