摘要
目的
分析胸膜肺炎放线杆菌（APP）临床分离株的优势血清型，获得疫苗候选菌株。
方法
从国内疑似分离株中鉴定获得53株APP菌株，鉴定各菌株血清型及评价其生物学特性后，利用大蜡螟和小鼠模型筛选评估有价值的疫苗候选菌株。
结果
53株APP中血清型占比由高到低依次为1、7、15、5型，各菌株在体外生长存活能力强，具有不同程度的溶血活性。MIC结果显示，分离菌株对氟苯尼考敏感度较低，而对头孢类药物高度敏感。用大蜡螟和小鼠模型从每个血清型菌株中各筛选到一株高毒力候选菌株。其中，1型菌株制备的灭活疫苗能够以小于商品化疫苗中1型菌株1/5的剂量，保护100%同血清型攻毒小鼠存活。同时，商品化疫苗中缺乏的15型菌株制备的灭活疫苗对同血清型攻毒小鼠保护率为66.7%，高于商品化疫苗的保护率。
结论
本研究筛选获得高毒力的优势血清型1、5、7、15型菌株各一株，根据免疫剂量和免疫保护率分析，其中的1型菌株和15型菌株有开发为新疫苗候选菌株的潜力。
胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）是猪的重要呼吸系统病原菌，能引起猪传染性胸膜肺炎，该病具有传染性强、致死率高的特点，急性病例以纤维性、出血性胸膜肺炎为特征，在世界范围内对养猪业造成广泛危害。抗生素是防治APP的有效手段，随着我国减抗、限抗政策的推进，APP耐药性问题也日益受到关注，为了减少抗生素的使用量，控制细菌耐药性的发生率，疫苗的使用显得更加重要。
根据细菌脂多糖与荚膜多糖等抗原不同，可将APP分为19个血清型。不同国家和地区的APP流行学血清型各不完全相同。在欧洲，血清型2、3、6、9较为流行，而墨西哥则以血清型1、3、5b、7流行最广泛，澳大利亚和韩国流行的优势血清型有1型和5型。2001年，逯忠新等经过流行病学调查7个不同省份流行血清型主要有1、3和7型；马爽等从23个省份1990—2014年的病料中分离鉴定到62株APP，其中2、5、7型菌株数量占总数的77.5%，但根据毒力强弱结果的分析，引起危害较大的主要为1、5、7型。随着时间变化，近几年国内5型、8型及15型等血清型也表现出流行趋势，而3型菌株检出率有所降低，卢碧凯等对临床分离株鉴定发现8型为近几年浙江地区优势血清型，其次为5、7、15型。灭活疫苗具有安全稳定、无返毒风险、易生产和运输等优点，不同国家和地区需要根据本地流行血清型研制相应的多价灭活疫苗。目前国内使用的商品化灭活疫苗抗原主要是血清型1、2、7型菌株，近几年也有研究者在山东地区分离到APP血清1、5、7型，以此制备三价灭活疫苗并评价其在猪身上的免疫保护效果。由于APP不同血清型之间交叉保护能力低，而血清流行情况又不断发生变化，已有的商品化疫苗可能对新流行的血清型菌株保护效果有限。因此，有必要在了解国内APP最新流行的优势血清型的基础上筛选新的疫苗候选菌株。
本研究拟对国内2021—2022年的APP临床分离菌株进行血清型分型鉴定，检测其生物学特性，并对其耐药性进行分析；同时筛选体外生长状况良好、毒力强的菌株作为疫苗候选菌株，在小鼠体内评价其免疫保护力，以期为传统疫苗的更新提供候选毒株。
1材料和方法
1.1材料
1.1.1菌株及实验动物
试验所用的APP临床菌株为2021—2022年疑似患有猪传染性胸膜肺炎的发病猪的病料中获得，由武汉科前生物股份有限公司诊断实验室分离并保存，临床分离菌株来源于广东、甘肃、四川等10个省份，其中，26株来自江西；7株来自云南；6株来自甘肃；4株来自陕西；3株来自海南；2株来自四川；2株来自福建；山西、广东、江苏各分离到1株。大蜡螟幼虫购自武汉维物起源生物科技有限公司；6周龄Balb/c雌鼠和4周龄KM雌鼠购自华中农业大学实验动物中心。
1.1.2主要试剂
胰蛋白大豆琼脂（TSA）、胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）购自美国BD公司；水解酪蛋白琼脂培养基（MH）购自OXOID北京拜尔迪生物技术有限公司；2×Taq Mixture及BCA蛋白浓度测定试剂盒均购自康为世纪生物科技有限公司；DNA Marker购自Takara公司；羊抗鼠HRP酶标二抗购自武汉三鹰技术有限公司；QIAGEN Multiplex PCR Kit购自德国QIAGEN公司；所有抗生素均购自biosharp兰杰柯公司；猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗购自武汉科前生物股份有限公司。
1.2方法
1.2.1临床菌株的鉴定及血清型分型
使用APP特异性基因apxIV片段引物进行鉴定，大小为422 bp，阳性对照为实验室保存的血清1型菌株4 074。进一步采用针对APP 1-15血清型特异性基因的引物进行扩增鉴定各菌株血清（表1）。PCR的反应体系为：模板1μL，2×Multiplex PCR Master Mix 10μL，上游引物各1μL，下游引物各1μL，ddH2O补齐至20μL。PCR反应条件：95℃预变性10 min；95℃变性15 s；60℃退火90 s；72℃延伸150 s；30个循环后；68℃再延伸10 min，PCR产物进行凝胶电泳。其中APP血清型1型、5型、7型和15型特异性基因分别为cps1B（959 bp）、cps5B（825 bp）、cps7E（601 bp）、cpscps15B和cps15C（1 595 bp）。
表1试验所用引物