摘要
在本研究中，利用野生型解脂耶氏酵母A101，使用来自不同工业的粗甘油生产脂质。我们测试了五种不同废产品未经任何预先纯化的样品；每种样品含有不同浓度的甘油（42%~87%）作为唯一碳源。脂质生产的最佳结果来自含有脂肪皂化甘油的培养基。在摇瓶实验中，脂质产量达到1.69 g·L⁻¹（占细胞干重的25%），生物量产量为0.17 g·g⁻¹。生物反应器中的分批培养进一步提高了脂质产量——达到4.72 g·L⁻¹，生物量产量为0.21 g·g⁻¹。此外，适当选择的粗甘油批次可提供特定的脂肪酸组成。总之，本文表明肥皂生产中的粗甘油可以在不经过任何预先纯化的情况下高效转化为单细胞油。
1. 引言
甘油是一种在制药、生物技术、化妆品和食品工业中具有多种用途的化合物。甘油是一种重要的可再生原料，是生物柴油生产的主要副产品，而生物柴油是一个庞大的产业。对不使用原油的运输燃料的持续需求增加了对生物柴油生产的重视。生物柴油（脂肪酸甲酯）是最适合替代石油的燃料，因为它具有与当前运输燃料相似的能量含量和燃烧特性。它通过短链醇（如甲醇）和碱催化对甘油三酯进行酯交换反应生产。该过程产生大量粗甘油，据估计，每生产1吨生物柴油约产生100 kg粗甘油。世界生物柴油市场预计到2016年将达到370亿加仑，这意味着将产生40亿加仑的粗甘油。如果要增强生物柴油的使用，粗甘油的利用问题亟需解决。粗甘油的有效利用将提高生物柴油的可行性。此外，粗甘油还由其他几个行业生产，包括脂肪皂化、硬脂酸生产和酒精饮料生产单元。皂化反应用碱水解脂肪和油脂（甘油三酯），产生两种产物——脂肪酸盐（也称为肥皂）和甘油。从脂肪和油脂制造肥皂通常产生约占肥皂重量10%的甘油。肥皂生产后粗甘油的有效利用可以抵消生产成本。
单细胞油（SCO）是一种重要的替代可再生生物燃料。虽然它们的效益-成本比较低且存在放大问题，但微生物生物燃料在环境和经济上更具可行性，因为它们有助于解决许多行业的废物问题。特别是，SCO的生产可以将每公顷土地的能源产量提高一个数量级，相对于油料作物的生产。此外，在农田中不存在粮食和生物柴油生产之间的竞争。此外，与传统的生物柴油生产相比，微生物生物燃料允许通过过表达参与特定脂质生物合成的关键酶来控制脂质类型和含量。
不幸的是，粗甘油含有许多污染物，如甲醇、盐、金属、非甘油有机物（MONG）。它还呈黄色至深棕色，这显著降低了其价值。粗甘油的纯化过程耗时耗能，因为它需要许多步骤，如通过过滤或分馏真空蒸馏进行精炼。由于纯甘油是一种具有多种应用的高价值产品，粗甘油为新的应用提供了巨大的机会。因此，人们越来越关注利用工业中的粗甘油来处理废物并抵消生物柴油、肥皂和硬脂酸的生产成本。尽管污染严重，粗甘油可以被解脂耶氏酵母——一种众所周知的产油酵母——轻松利用。解脂耶氏酵母是研究最广泛的"非常规"酵母之一，因其生物技术潜力而备受关注。这种非常规酵母已被归类为GRAS（公认安全）生物，可以代谢甘油，在生产柠檬酸和其他有机酸、单细胞油（SCO）、赤藓糖醇、甘露醇或蛋白质方面具有巨大的生物技术潜力。
在本研究中，我们使用了从被汽油和柴油污染的土壤中分离的野生型解脂耶氏酵母A101菌株。为了验证来自不同工业部门的含甘油废物的应用可能性，我们测试了五种含有不同浓度甘油（42%~87%）作为碳源的废产品。作为对照，使用了纯甘油。摇瓶实验中脂质生产的最佳结果来自含有脂肪皂化生产甘油的培养基。它达到了1.69 g·L⁻¹（占细胞干重的25%）；此外，放大后达到了4.72 g·L⁻¹。解脂耶氏酵母在粗甘油上生长产生的油的脂肪酸组成具有作为低多不饱和脂肪酸（PUFA）含量生物柴油原料的潜力。本研究评估了利用野生型解脂耶氏酵母A101菌株生物转化粗甘油并形成单细胞油的潜力。迄今为止，尚未发表关于直接使用肥皂和硬脂酸生产中的粗甘油合成SCO的报告。
2. 方法
2.1. 酵母菌株
本研究中使用的菌株是野生型解脂耶氏酵母A101，属于波兰弗罗茨瓦夫环境与生命科学大学生物技术与食品微生物学系。
2.2. 工业废物作为解脂耶氏酵母的底物
粗甘油批次来自5家公司。粗甘油的成分列于表1和表2中。用水稀释并过滤后，根据以下描述的方法通过HPLC测定甘油浓度。
灰分含量通过在600°C的炉中过夜加热样品测定。然后测量灰分重量。元素通过原子吸收光谱法（AAS）测定。氮通过CHNS EA1110元素分析仪（Fisons Instruments）上的干燃烧后气相色谱法测定，符合ISO标准PN-ISO 13878:2002。粗甘油中的脂质含量通过以下描述的气相色谱法检测。
2.3. Bioscreen C
酵母菌株在100孔板中生长，每孔200 μL YNB培养基，补充2%（w/v）粗甘油。首先，酵母在YPG培养基中生长24小时，该培养基含有1%（w/v）酵母提取物、1%（w/v）蛋白胨和2%（w/v）葡萄糖。洗涤细胞后，接种至每孔OD₆₀₀为0.1。在28°C下使用Bioscreen C全自动微生物生长曲线分析仪（Oy Growth Curves Ab Ltd.，芬兰）在持续搅拌下进行五组实验。通过每30分钟测量420~560 nm处的光密度来监测生长，持续92小时。
2.4. 摇瓶实验
接种物用富YPG培养基。摇瓶实验的生产培养基由YNB（不含氨基酸和硫酸铵，Sigma，德国）组成，补充50 g·L⁻¹纯甘油（POCH，波兰）或粗甘油，并添加足够的(NH₄)₂SO₄以达到所需的C/N摩尔比，pH 6.0。在摇瓶实验中，培养物在含有0.05 L培养基的0.25 L摇瓶中，在旋转摇床（CERTOMAT IS，Sartorius Stedim Biotech）上于28°C、240 rpm下培养120小时。
2.5. 生物反应器实验
为了准备在生物反应器中生产SCO的接种培养物，培养物在0.3 L摇瓶（含0.1 L YPG培养基）中于28°C在摇床上培养72小时。将0.2 L接种物引入生物反应器中，该反应器含有YNB培养基（不含氨基酸和硫酸铵，Sigma，德国），补充粗甘油G1至终浓度150 g·L⁻¹，并添加适量的(NH₄)₂SO₄，C/N比为75和100。培养在5 L罐式生物反应器（Biostat B Plus，Sartorius，德国）中进行，工作体积为2 L，温度28°C。通气量固定为0.6 L·min⁻¹。搅拌速度调整为800 rpm，溶解氧浓度维持在25±5%。pH通过添加NaOH（20% w/v）维持在6.0。在分批培养过程中，蒸发受到限制，因为废气进入排气冷凝器，水分返回容器。培养进行两次重复。
2.6. 分析方法
从培养物中取10 mL样品，离心（10分钟；4°C；5500×g），在0.45 μm孔径膜上过滤收集，并用蒸馏水洗涤两次。生物量在105°C干燥后通过重量法测定。甘油和柠檬酸的浓度通过HPLC测定，使用HyperRez Carbohydrate H⁺柱（Thermo Scientific，Waltham，MA），耦合UV检测器（k=210 nm）（Dionex，Sunnyvale，USA）和折射率（RI）检测器（Shodex，Ogimachi，Japan）。柱子在65°C下用25 mM三氟乙酸（TFA）洗脱，流速为0.6 mL·min⁻¹。
2.7. 脂质提取和脂肪酸表征
冻干生物质中的脂肪酸（FAs）通过以下描述的方法衍生化为脂肪酸甲酯（FAMEs）。简要地说，将生物质（约10~20 mg）与2 mL 2.5%硫酸甲醇溶液（含50 μg/mL C17:0作为内标）在带特氟龙盖的玻璃管中混合。剧烈混合2分钟，然后在80°C下孵育90分钟以形成FAMEs。通过添加1 mL己烷和0.5 mL 0.9%盐水溶液提取FAMEs，混合并离心进行相分离。含有FAMEs的有机相转移到玻璃小瓶中进行GC分析。FAMEs通过GC-2010 Plus仪器（Shimadzu，Japan）上的气相色谱法分析，配备火焰离子化检测器（FID）和自动进样器（AOC-20i）。FAMEs使用70%氰丙基聚硅苯基硅氧烷柱（TR-FAME，30 m×0.32 mm×0.25 μm）分离。初始炉温为130°C，保持1分钟。然后以5°C·min⁻¹升至200°C。再以10°C·min⁻¹升至250°C并保持1分钟。进样器和检测器的温度分别为270°C和280°C。氦气用作载气，恒定流速为1.52 mL·min⁻¹。进样体积为1 μL，分流比为1:5。
FAME鉴定使用Supelco 37组分FAME混合物作为参比标准。庚酸作为内标进行定量。DCW中的总脂质含量计算为所有脂肪酸的总和。
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