2.5 选定抗菌药物最低抑菌浓度的测定
使用稀释法在96孔微量滴定板中进行测试。简要步骤如下：将耻垢分枝杆菌（1×10⁵ CFU）接种于100 μL补充卡那霉素和四环素的Sauton培养基中，以及一系列待测抗菌药物浓度。平板在37°C下孵育三天。MIC确定为孵育3天后未检测到可见生长的最低浓度。每次实验制备新鲜抗菌药物储备液；进行了四个独立实验。
2.6 重组PASTA蛋白对结核分枝杆菌生长的影响
按照先前描述的方法纯化重组PASTA，并在生长实验前过滤灭菌。将分枝杆菌（10³细胞 mL⁻¹）接种于含有不同浓度无菌rPknB_PASTA的补充7H9培养基的16孔微量滴定板中。每个浓度接种四个重复。密封平板在37°C下不振荡孵育。孵育15天和25天后测量光密度。实验重复两次。当分枝杆菌在Falcon管或锥形塑料瓶中培养时获得类似结果。将结核分枝杆菌静止期培养物在4°C下保存两个月，将2×10⁴细胞 mL⁻¹接种于锥形瓶中。将烧瓶在37°C下孵育长达12周。定期使用Jenway分光光度计测量光密度。检测进行三重复，共三次。
2.7 转录谱分析
使用TRIzol方法从10 mL指数生长期分枝杆菌培养物中分离总RNA。在使用Superscript逆转录酶II和基因特异性引物生成cDNA之前，用Turbo DNAfree DNA酶去除DNA污染。使用Corbett Rotor Gene 6000实时热循环仪和Absolute QPCR SYBR Green混合物以及基因特异性引物进行Q-PCR。表达水平相对于16S rRNA进行标准化。
2.8 蛋白质电泳和Western印迹
通过离心收集分枝杆菌，用PBS洗涤并重悬于含50 mM Tris-HCl（pH 8.0）和150 mM NaCl的缓冲液中。使用FastPrep-24仪器（MP Biomedicals，英国）和玻璃珠裂解细菌。裂解物以14,000 g离心20分钟以分离可溶性和不溶性部分。使用12% SDS-PAGE分离蛋白质并转移到硝酸纤维素膜上。一抗为抗多组氨酸抗体（Sigma）；碱性磷酸酶偶联抗小鼠抗体用作二抗。使用Sigma Fast BCIP/NBT作为底物来可视化识别的蛋白质。
2.9 用于蛋白质组学分析的膜蛋白组分的分离
按照先前描述的方法制备膜组分。简要步骤如下：将耻垢分枝杆菌TMP和MIND菌株接种于含500 mL Sauton培养基的2 L锥形瓶中。培养物在37°C下振荡（200 rpm）培养3小时。使用来自两个烧瓶的培养物制备每个菌株的膜组分。细菌以6,000 g离心20分钟收获，并用PBS洗涤。将沉淀重悬于10 mL提取缓冲液中，含50 mM Tris-HCl（pH 8.0）、150 mM NaCl、10 mM MgCl₂，并在冰上搅拌10分钟。在添加每克细胞100 mg DNA酶I之前对细胞悬液进行超声处理，并在冰上搅拌5分钟以降低粘度。悬浮液在4°C下以25,000 g离心25分钟。弃去沉淀，上清液在4°C下以100,000 g离心60分钟。弃去上清液后，将沉淀小心重悬于100 mM碳酸钠缓冲液（pH 11.5）中，并以100,000 g离心60分钟。在使用无菌MilliQ水进行最终重悬和离心步骤之前，碳酸钠缓冲液中的离心和重悬步骤至少重复三次。将膜组分重悬于1 mL无菌去离子水中并冷冻干燥。
2.10 膜蛋白分析
蛋白质组学由莱斯特大学蛋白质组学设施（PNACL，莱斯特大学）进行。使用滤膜辅助样品制备方法对膜蛋白进行胰蛋白酶消化。使用RSLCnano HPLC系统（Dionex，英国）和LTQ-Orbitrap-Velos质谱仪（Thermo Scientific）进行LC-MS/MS。肽以0.3 mL min⁻¹的流速从捕集柱中洗脱，并通过反相PicoFrit毛细管柱（75 μm内径×400 mm）洗脱，该柱含有Symmetry C18 100 Å介质（Waters，英国），使用高压装置（Proxeon Biosystems，丹麦）在4小时内填充，柱的输出直接喷入LTQ-Orbitrap-Velos质谱仪的纳喷雾离子源。
使用Proteome DISCOVERER处理从每次LC-MS/MS采集获得的原始数据文件，依次使用MASCOT搜索UniProtKB-Swissprot数据库。肽容差设置为10 ppm，MS/MS容差设置为0.02 Da。固定修饰设置为脲甲基化（C），可变修饰设置为氧化（M）。进行了诱饵数据库搜索。使用SCAFFOLD Q+S 4进一步处理Proteome DISCOVERER的输出。对于定量实验，按照制造商的说明使用TMTsixplex标记试剂盒标记消化后的肽。使用SCAFFOLD Q+进行基于标记的定量（iTRAQ、TMT、SILAC）肽和蛋白质鉴定。如果蛋白质和肽鉴定能够以大于95.0%的概率建立并包含至少两个已鉴定的肽，则接受。X!Tandem的肽概率由Peptide Prophet算法分配，并进行SCAFFOLD delta-mass校正。MASCOT的肽概率由SCAFFOLD Local FDR算法分配。质谱蛋白质组学数据已存入ProteomeXchange联盟，通过PRIDE合作伙伴存储库，数据集标识符为PXD002120和10.6019/PXD002120。
2.11 分析凝胶过滤
将50 μL浓度为50 μM的PknB_PASTA以0.4 mL min⁻¹的流速注入S75 10/300柱（GE Life Science）。用25 mM Tris-HCl（pH 8.5）和100 mM NaCl（含或不含25 mM MgSO₄）平衡柱子。对于在不含MgSO₄的缓冲液中注入，蛋白质预先与5 mM EDTA孵育。对于在MgSO₄存在下进行凝胶过滤的情况，蛋白质预先与25 mM MgSO₄孵育。
2.12 核磁共振实验
所有核磁共振（NMR）实验在20°C下于Bruker Avance III 700（¹H-¹⁵N双共振实验）或Avance III 500（¹H-¹³C-¹⁵N三共振实验）光谱仪上进行，配备5 mm z梯度TCI低温探头，使用标准脉冲序列。NMR样品由约50 μM ¹⁵N标记的蛋白质组成，溶于10 mM磷酸盐缓冲液（pH 6.8）、100 mM NaCl中，含5% D₂O用于锁定。
相关新闻推荐
1、空气中的微生物主要的种类、来源、影响因素及健康风险（三）
3、3种植物精油对调理牛排腐败贮藏过程优势腐败菌生长抑制情况及细菌生长曲线（一）