2.3抑菌物质效价计算公式
Nisin浓度的标准曲线如图5所示,线性拟合方程为:Y=1.179 3+5.177 1X(R2=0.928)。根据此方程可计算抑菌试验中乳酸菌无菌发酵上清液所对应的细菌素当量对数值[lg(mg/mL)]。由于乳酸菌无菌发酵上清液经过10倍浓缩,且商品化Nisin效价单位为900 IU/mg,最终计算公式为:
乳酸菌无菌发酵上清液抑菌物质效价(IU/mL)=10X/10×Nisin效价单位(900 IU/mg)。
图5 Nisin浓度的标准曲线
2.4分离乳酸菌的抑菌活性及抑菌物质效价
对分离的乳酸菌F3-1①、N3-1①、N4-1①、N5-1①、N7-1①以及屎肠球菌5号株、戊糖乳杆菌12号株,通过牛津杯法对金黄色葡萄球菌ATCC29213株进行抑菌试验。由图6可知,在相同条件下,N3-1①产生的抑圈菌直径最大,达到了22.68 mm,具有最强的抑菌活性;F3-1①、屎肠球菌5号株、戊糖乳杆菌12号株、N4-1①、N5-1①、N7-1①具有一定的抑菌活性。根据抑菌物质效价公式,计算出各菌株所产抑菌物质效价,见表2。结果表明,粪肠球菌N3-1①具有最高的抑菌物质效价,数值为1.28×106 IU/mL;其次为戊糖乳杆菌12号株,抑菌物质效价达到了1.21×105 IU/mL;再次为屎肠球菌5号株,抑菌物质效价达到了3.58×104 IU/mL。
图6不同乳酸菌抑菌作用观察F3-1①:粪肠球菌;N3-1①:粪肠球菌;N4-1①:屎肠球菌;N5-1①:屎肠球菌;N7-1①:未知菌株;5:屎肠球菌5号株;12:戊糖乳杆菌12号株;MSR:MSR肉汤培养基;ddH2O:双蒸水。下图同。
表2不同乳酸菌抑菌效果大小比较
2.5不同处理下抑菌试验结果
牛津杯试验表明,在分离的乳酸菌中N3-1①对金黄色葡萄球菌ATCC29213株具有最强的抑菌活性。在此基础上,通过制备不同处理下的N3-1①无菌发酵上清液,开展进一步抑菌试验,探究乳酸菌所产抑菌物质的种类。由图7和表3可知,N3-1①的无菌发酵上清液经冷冻干燥、1/10体积浓缩后表现出较强的抑菌活性,抑菌圈直径达23.36 mm;经NaOH调pH至6.5左右,抑菌圈消失,表明发挥抑菌作用的活性物质可能为有机酸类等酸性物质;本试验未观察到H2O2在NaOH对无菌发酵上清液的处理中发挥进一步的作用。
图7 N3-1①在不同处理下的抑菌作用观察
表3 N3-1①在不同处理下的抑菌效果比较
2.6不同pH乳酸抑菌试验结果
抑菌试验结果显示,N3-1①、N4-1①、N5-1①、N7-1①、戊糖乳杆菌5号株按1%的接种量接种于MRS肉汤培养基中,在37℃培养24 h后,无论是否经过NaOH处理,上述乳酸菌无菌发酵上清液(未经过1/10体积浓缩)经牛津杯检测未能观察到抑菌现象(图8)。由表4可知,除N3-1①无菌发酵上清液pH为4.1外,其余4株乳酸菌无菌发酵上清液pH均为3.8,该结果表明乳酸菌无菌发酵上清液pH高于3.8时,不能有效抑制指示菌金黄色葡萄球菌ATCC29213株的生长。将乳酸溶液采用灭菌蒸馏水稀释至4个不同的pH,分别为1.4、2.1、3.0、3.8,采用牛津杯法进行抑菌试验,结果(表5)显示,当pH为1.4时,乳酸溶液对金黄色葡萄球菌ATCC29213株表现出强抑制作用;当pH为2.1时,乳酸溶液对指示菌表现出一定的抑制作用;当pH为3.0和3.8时,没有观察到乳酸溶液对指示菌的抑制作用。
图8 NaOH处理及乳酸抑菌试验结果F:未经NaOH处理;C:经NaOH处理。
表4 5株乳酸菌在NaOH处理下的抑菌作用
3讨论
本试验从牛粪、羊瘤胃内容物及青贮饲料中总计分离出了29株细菌,其中来自牛粪的疑似大肠杆菌18株,来自羊瘤胃内容物的疑似乳酸菌9株,来自青贮饲料的疑似乳酸菌2株。我们通过NCBI序列比对鉴定出细菌的种属,挑选生长性能较好的4株疑似乳酸菌N3-1①、N4-1①、N5-1①、N7-1①分离纯化后对菌株进行革兰氏镜检,显示均为革兰氏阳性菌株,过氧化氢酶接触试验均为阴性。
牛津杯双层平板法试验结果表明,从羊瘤胃内容物中分离的粪肠球菌N3-1①具有最强的抑菌活性,其他试验菌株培养24 h后的无菌发酵上清液所形成的抑菌圈直径较小,具有一定的抑菌活性。何江波等从羊瘤胃内容物中分离出22株乳酸菌(包括戊糖乳杆菌、粪肠球菌、蒙氏肠球菌、海氏肠球菌等),在排除酸效应后,所有菌株发酵上清液均未检测到抑菌活性。本试验所得结果与上述研究结果相似。
Korhonen等证明,乳酸菌中发挥主要抑菌作用的是乳酸和醋酸,与本研究的结果有相似之处。研究显示,乳酸菌产酸能力强,能快速产生大量乳酸等有机酸,形成低pH环境,抑制有害菌的生长。陈宏伟等研究表明,乳酸菌通过细菌素发挥主要抑菌作用,在乳酸形成的有机酸性环境中,细菌素发挥的效果更好。有研究表明,乳酸菌可通过细菌素、H2O2等发挥抑菌效果。
有机酸可以通过酸(未电离形式)的扩散穿过细胞膜,解离和酸化细胞质。此外,解离的有机酸也会使细菌的酶、蛋白质和DNA变性,从而抑制细菌生长。李雪莉等研究表明,乳酸菌主要通过有机酸来发挥抑菌作用。叶青对云南建水酸浆豆腐中是乳酸菌进行了分离与鉴定,研究发现酸浆中主要微生物自然发酵后的有机酸产物主要为L-乳酸。我们后续将对上述有抑菌活性的乳酸菌作进一步研究,以明确其主要抑菌物质。
4结论
本试验从羊瘤胃内容物中分离出了1株对金黄色葡萄球菌ATCC29213株有良好抑菌活性的乳酸菌——粪肠球菌N3-1①,其发挥抑菌活性的物质为有机酸类。通过不同pH乳酸抑菌试验得出乳酸对金黄色葡萄球菌ATCC29213株发挥抑菌作用的最适pH为1.4~2.1。
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