摘要
口腔共生链球菌在口腔生物膜形成中起着关键作用，并通过与致病菌（如变形链球菌）竞争和拮抗其生长来促进牙齿健康。共生链球菌有效利用口腔中的多种碳水化合物对其持久定植至关重要，然而对这些生物体碳水化合物分解代谢的调控知之甚少。我们以丰富的口腔共生菌戈登氏链球菌DL1株为模型，利用外切-β-D-果糖苷酶基因(fruA)和一个果糖/甘露糖糖：磷酸转移酶系统(PTS)酶II操纵子(levDEFG)作为模型系统，研究了其碳水化合物分解代谢物抑制(CCR)。功能研究证实了FruA和LevD在戈登氏链球菌中的预测作用。ManL，一种果糖/甘露糖型酶II PTS渗透酶的AB结构域，参与了葡萄糖、甘露糖、半乳糖和果糖的利用，并对fruA和levD操纵子的CCR施加主要控制。与变形链球菌不同，ManL依赖的CCR不是糖特异性的，并且半乳糖在戈登氏链球菌中能非常有效地引发CCR。戈登氏链球菌中明显的ccpA同源物的失活实际上增强了对fruA和levD的CCR，这种效应可能源于其已证实的对manL表达的抑制作用。因此，口腔病原体变形链球菌和口腔共生菌戈登氏链球菌在CCR控制机制上存在一些相似性和根本性差异，这可能最终被用来增强健康相关共生菌在口腔生物膜中的竞争力。
引言
人类口腔提供了一个复杂而丰富的营养源，支持着多种微生物的生长，目前已在口腔中检测到超过750种细菌系统型。然而，相对较少的属占据了种群的大部分，口腔链球菌是人类口腔最早的定植者和最丰富的居民之一。口腔共生链球菌包括血链球菌群、唾液链球菌群、米氏链球菌群和咽峡炎链球菌群的成员，其中许多与牙齿和牙周健康相关。相比之下，人类龋齿的主要病原体变形链球菌通常不在健康牙齿组织上占显著比例。相反，当宿主的饮食过度富含碳水化合物时，这种微生物会大量繁殖，这在很大程度上是由于其与许多共生链球菌相比，具有更强的产酸和耐酸能力。值得注意的是，许多口腔共生链球菌可以通过产生过氧化氢和其他抑制性物质来抑制变形链球菌的生长。由于人们普遍认识到龋齿具有生态学基础，因此全面了解共生菌用来获得相对于致龋微生物的选择性优势的机制，将有助于合理设计技术，以阻止不良生物的定植和致病。
碳水化合物是链球菌属生长的主要能量来源，它们缺乏完整的呼吸链。虽然有一些链球菌通过ABC转运蛋白或同向转运系统内化碳水化合物的例子，但摄取碳水化合物的主要高亲和力、高通量途径是磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)依赖的糖：磷酸转移酶系统(PTS)。PTS由通用组分酶I(EI)和组氨酸磷酸载体蛋白(HPr)，以及一系列底物特异性酶II(EII)复合物组成。EI催化PEP对HPr的His15进行磷酸化，随后磷酸基团转移到PTS渗透酶的EIIA结构域，然后到EIIB结构域，接着是膜相关EIIC结构域介导的单糖或二糖的内化和并发磷酸化，对于某些渗透酶，有时还涉及EIID结构域。与大多数细菌一样，当存在快速代谢的碳水化合物时，链球菌中利用非偏好碳水化合物的基因会受到抑制。因此，碳分解代谢物抑制(CCR)在这些细菌中很常见，使生物体能够优化能量生成。
大多数低G+C含量革兰氏阳性菌中CCR的主要途径涉及PTS的HPr和分解代谢物控制蛋白A(CcpA)，后者结合在CCR敏感基因启动子区域的分解代谢物响应元件(CRE)上并调节其转录。CcpA的DNA结合活性通过与其Ser46磷酸化形式的HPr(HPr-Ser-P)相互作用而增强，并且在某些情况下可以被某些糖酵解中间体（如果糖-1,6-二磷酸）的存在所刺激。尽管变形链球菌中的CcpA同源物可以影响中心碳代谢的调节，但CcpA在变形链球菌的CCR中并不起主导作用。相反，HPr-Ser-P和三种EII复合物(EIIABMan,FruI和EIILev)在转录和转录后水平上对非偏好碳水化合物的转运和分解代谢施加主要控制。
口腔共生链球菌和变形链球菌的代谢途径、营养需求和基因组结构相似，因此它们可能在口腔中竞争共同的营养物质。作为最丰富的口腔共生菌之一和口腔的早期定植者，戈登氏链球菌在口腔生物膜形成过程中与各种口腔细菌相互作用，并能够拮抗变形链球菌的生长。值得注意的是，变形链球菌和戈登氏链球菌在CCR调节方面已经存在一些明显差异。特别是，虽然CcpA在变形链球菌的CCR中不占主导地位，但戈登氏链球菌的ccpA突变体显示精氨酸脱亚胺酶途径的CCR丧失，淀粉酶结合蛋白表达异常，以及青霉素耐受性丧失。如果口腔共生菌和变形链球菌确实以根本不同的方式管理CCR，那么或许可以设计出能够破坏变形链球菌持久存在能力而不干扰共生菌生长的治疗方法。使用我们在变形链球菌和戈登氏链球菌中显示具有相似功能的两个CCR敏感模型系统，我们证明了这些竞争性微生物在碳水化合物分解代谢的整体调控上存在核心相似性和显著差异。
材料与方法
细菌菌株和培养条件。本研究中使用的野生型戈登氏链球菌DL1株及其衍生株在脑心浸液肉汤(BHI;Difco Laboratories,Detroit,MI)中于37°C、5%CO2和95%空气条件下维持，必要时添加以下浓度的抗生素：卡那霉素(1.0 mg ml⁻¹)、红霉素(10μg ml⁻¹)和壮观霉素(500μg ml⁻¹)。用于氯霉素乙酰转移酶(CAT)测定和测量生长速率的戈登氏链球菌培养物在含有指定量的葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖或菊粉的TV基础培养基中制备。用于PTS测定的细胞在保持85%N2、10%H2和5%CO2的厌氧室中培养。所有化学试剂和抗生素均购自Sigma Chemical(St.Louis,MO)。使用Bioscreen C监测仪(Oy Growth Curves AB,Helsinki,Finland)生成戈登氏链球菌菌株的生长曲线，每30分钟读取一次读数。大肠杆菌菌株在Luria-Bertani培养基中生长，需要时添加以下浓度的抗生素：卡那霉素(40μg ml⁻¹)、红霉素(300μg ml⁻¹)和壮观霉素(50μg ml⁻¹)。
DNA操作。采用标准重组DNA技术构建质粒。所有限制性内切酶和修饰酶均购自Invitrogen(Carlsbad,CA)或New England Biolabs(Beverly,MA)，并按供应商推荐使用。使用购自Qiagen(Valencia,CA)的QiaQuick DNA纯化试剂盒进行DNA纯化。所有引物由Integrated DNA Technologies(Coralville,IA)合成。采用PCR连接诱变方法，用非极性红霉素抗性标记替换fruA、levD和manL的编码序列。为构建manL ccpA双突变体，将ccpA的0.9-kbp内部片段通过PCR扩增并克隆到pUC19上。随后将非极性壮观霉素抗性盒插入ccpA基因的EcoRV位点，并通过感受态转化将该突变引入manL突变体中。所有工程菌株均通过PCR和DNA测序进行验证，包括确定用于重组的臂的染色体内容序列，以确保在目标基因之外没有引入意外的突变。
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