2 结果
2.1 pVSV-ΔG-EEEV-E3E2E1-EGFP重组质粒的鉴定结果
以合成的EEEV E3E2E1蛋白编码基因为模板，将EEEV E3E2E1基因通过同源重组方式克隆入pVSV-ΔG-EGFP载体中获得pVSV-ΔG-EEEV- E3E2E1质粒，PCR扩增EEEV E3E2E1基因通过1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。可以看到约3 000 bp大小的条带，与预期目的条带大小一致。测序结果显示序列正确，这说明成功构建了pVSV-ΔG-EEEV- E3E2E1。
2.2 rVSV-ΔG-EEEV-E3E2E1-EGFP重组病毒感染细胞的荧光观察结果
将测序成功的pVSV-ΔG-EEEV-E3E2E1-EGFP质粒与4个辅助质粒pBS-N、pBS-P、pBS-G、pBS-L共同转染BHK-21细胞，p1代开始出现绿色荧光，P2代之后开始绿色荧光明显增多，表明重组病毒拯救成功。
2.3 rVSV-ΔG-EEEV-E3E2E1-EGFP重组病毒单斑挑取免疫荧光鉴定结果
将rVSV-ΔG-EEEV-E3E2E1-EGFP单斑病毒感染BHK-21细胞48 h后的免疫荧光结果，在488 nm波长下可观察到EGFP报告基因表达的绿色荧光，表明病毒成功感染细胞并具备复制能力；同时在550 nm波长下可见由Cy3标记二抗所产生的红色荧光，证实EEEV E3E2E1蛋白在感染细胞中正确表达。
2.4 rVSV-ΔG-EEEV-E3E2E1-EGFP重组病毒的Western blot鉴定结果
将rVSV-ΔG-EEEV-E3E2E1-EGFP重组病毒经SDS-PAGE后转膜，利用本室前期制备的EEEV-E2多克隆抗体为一抗，蛋白印迹结果显示出特异的条带，与预期大小一致，约为42 kDa。
2.5 rVSV-ΔG-EEEV-E3E2E1-EGFP重组病毒生长曲线结果
利用Bioscreen C生长曲线分析仪实时监测rVSV-ΔG-EEEV-E3E2E1-EGFP和VSV-EGFP在BHK-21细胞中的增殖动态。结果显示，两种病毒的生长趋势高度一致。rVSV-ΔG-EEEV-E3E2E1-EGFP在感染后约24小时进入对数生长期，并于48小时左右达到平台期，其最大OD₄₉₀ nm值与VSV-EGFP相当，表明重组病毒的体外增殖活性与野生型VSV基本一致。
2.6 rVSV-ΔG-EEEV-E3E2E1-EGFP的透射电子显微镜观察结果
为了观察重组病毒的形态特征，以MOI=0.001的rVSV-ΔG-EEEV-E3E2E1-EGFP病毒感染BHK-21细胞，待细胞病变显著后收集样本，经超薄切片制样进行透射电镜观察。结果显示重组病毒呈现较经典的弹状病毒形态，长约170~180 nm，短轴切面约70~80 nm。这说明rVSV-ΔG-EEEV-E3E2E1-EGFP重组病毒制备成功。
2.7 rVSV-ΔG-EEEV-E3E2E1-EGFP感染细胞后增殖动态变化结果
为探究不同MOI rVSV-ΔG-EEEV-E3E2E1-EGFP 感染细胞之后荧光蛋白表达的动态变化，以 MOI=0.001、0.01、0.1和1分别感染 BHK-21 细胞，于感染后不同时间点自动检测 EGFP 荧光强度。结果显示，病毒感染细胞之后荧光强度变化呈现显著的MOI依赖性，MOI=0.1时感染时病毒增殖较好且最终达到的荧光强度峰值更高。
3 讨论
EEEV受气候变化和生态因素影响，近年其潜在地理扩散风险增加，加之缺乏特效防控手段，对公共卫生安全构成严重威胁。本研究利用VSV-反向遗传学技术系统，成功的将EEEV包膜蛋白替代VSV-G蛋白，赋予重组假病毒结合宿主细胞和介导膜融合的能力，从而可以模拟EEEV的感染过程。本研究在构建假病毒过程中，痘病毒作为T7 RNA聚合酶的表达载体，其残留病毒可能会影响单一重组假病毒的获得。阿糖胞苷可通过选择性抑制DNA聚合酶，从而阻断痘病毒基因组复制而不影响VSV的增殖。单斑纯化会进一步筛选出完整插入EEEV-E3E2E1基因的重组病毒。通过联合应用阿糖胞苷抑制与单斑纯化技术，本研究最终获得纯化的rVSV-ΔG-EEEV-E3E2E1-EGFP。
此外，生长动力学结果显示，通过Bioscreen C全自动生长曲线分析仪实时监测，rVSV-ΔG-EEEV-E3E2E1-EGFP的病毒增长速率与VSV-EGFP相较一致，均在感染后约48小时达到增殖高峰。相较于传统的空斑实验，Bioscreen C系统能够实现连续、非侵入式的实时监测，不仅减少了人工操作步骤和时间成本，还提供了更丰富的动力学数据，如延滞期、对数生长期和平台期的精确界定。鉴于rVSV-ΔG-EEEV-E3E2E1-EGFP感染细胞之后荧光蛋白可以表达，而且荧光强度可直观反映病毒复制活性。有研究显示，基于VSV重组病毒可实现荧光强度的量化，在血清中和抗体检测中通过量化荧光强度衰减即可直观判定中和效价。该方法相较于需要细胞固定染色、肉眼计数的空斑减少中和实验来说，由于重组假病毒感染细胞之后EGFP荧光信号可高通量细胞成像系统自动化检测，将中和效价判定流程压缩至1/3时间，大幅提升检测通量，并显著保障实验人员的生物安全。Lin等人在EBV中开发了EBV-GFP荧光成像中和抗体检测法，基于GFP的自动化荧光分析可提供高达700倍的动态检测范围，且与经典中和实验和其gp350 IgG抗体滴度显著相关，为大样本临床血清筛查提供了可靠方法。
综上所述，本研究成功构建了携带EGFP报告基因、表达EEEV E3E2E1包膜糖蛋白复合物的rVSV-ΔG-EEEV-E3E2E1-EGFP假病毒，为后续深入研究EEEV感染机制及疫苗、抗体评价体系奠定了技术基础。
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