摘要
目的:未折叠蛋白质反应UPR是酵母最重要蛋白质质量控制机制之一,研究UPR响应规律有助于优化异源蛋白分泌途径合成和应对酸醇等胁迫因子的细胞自我保护。方法:选择实验室菌株W303-1A和工业菌株An-a,以UPRE启动子控制下的Lac Z为报告基因,利用CRISPR/Cas9技术构建得到指示菌株W303-1A(leu 2::UPRE-lac Z)和An-a(leu 2::UPRE-lac Z),分别简称WZ和AZ。结果:生长曲线测定显示WZ和AZ与亲本菌株的生长接近;添加下述试剂孵育4h后测定β-半乳糖苷酶酶活:1μg/ml衣霉素、8%(v/v)乙醇、0.3%(v/v)乙酸、5%(v/v)乙醇+0.1%(v/v)乙酸;菌株AZ的比酶活分别是对照值的8.2、26.4、1.1和7.9倍,而菌株WZ则分别为12.6、2.4、1.0和1.0倍;进一步以YEplac195为载体表达β-葡萄糖苷酶,AZ和WZ转化子在2%纤维二糖中生长24h的β-葡萄糖苷酶酶活值分别为0.35和6.12U/ml,相应的LacZ则分别为对照值的3.1和5.4倍。结论:两个菌株显示了在抑制物和异源蛋白表达UPR响应和调控能力上的显著差异,为其改造利用提供了方向;研究也为分析抑制物耐受性和异源蛋白表达关键制约因素、优化酵母ER和UPR信号通路的调控奠定了初步方法基础。
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作为真核模式生物和最重要的真核微生物细胞工厂,多年来被广泛应用于工业生产及生物学研究,近年来更是越来越广泛地应用于医药蛋白和工业应用蛋白的异源分泌表达。而酵母中的分泌途径(secretory pathway)蛋白质表达,不论内源性的表达还是异源性的表达,都涉及蛋白质的定向、转位和转运,受到酵母细胞自身蛋白质质量控制系统(protein quality control)的调控和制约。作为最重要质量控制机制之一的未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR),当内质网(endoplasmic reticulum,ER)中大量积累未折叠或错误折叠蛋白质时会被激活,在转录水平上调节内质网中催化分泌蛋白质折叠、装配和修饰的酶,确保正确折叠和装配完全的复合体继续通过分泌途径,而不能正确折叠和装配完全的蛋白质,则在另一质量控制机制-内质网关联降解(ER-associated degradation,ERAD)的共同作用下被降解。
UPR维持内质网稳态和恢复细胞功能,是酵母中非常保守的一种细胞自我保护性措施,但是,过强或者持续时间过久的内质网应激,会使UPR从保护细胞生存反应转变为促凋亡反应,最终导致细胞死亡。异源蛋白质在酵母中的分泌途径表达,也会导致ER压力、触发UPR响应,从而制约最终的产量和质量。为了提高宿主的ER加工容量,缓解ER胁迫压力,人们对酵母分泌途径进行改造和优化,选择性地高表达异源蛋白加工修饰过程的关键蛋白元件,包括强化促进正确折叠的分泌元件,以突破各个关键节点的限制,进而提高酵母异源蛋白胞外分泌或锚定表达的效率。
在生物质燃料乙醇领域,由于底物的特殊性,分泌途径表达纤维素酶,使酵母在拥有优良产醇性能的同时,能直接利用木质纤维素原料产醇,对能源结构调整、环境保护等都具有重要意义。而此类酵母工程菌株的应用,除了异源蛋白质表达共性问题外,还面临高底物浓度、高渗透压、多种抑制物抑制等不利反应条件;高浓度的乙酸、甲酸、糠醛和乙醇等组分都会降低酵母细胞活性和影响产醇性能。近年来新发现乙酸、乙醇等也能激活UPR信号通路:日本Nozomi Kawazoe等报道了>0.2%(v/v)醋酸胁迫处理诱导了内质网中错误折叠蛋白的积累和Ire1p及Hac1p的活化;西班牙Elisabet NT等人则发现乙醇可以导致细胞膜的流动性改变,进而激活UPR途径。这些发现证明UPR途径的激活不限于未折叠/错误折叠蛋白信号,也可以源自一些代谢途径上的胁迫作用,从新的角度提示了酵母菌株自身抗不利因素胁迫能力在酵母异源蛋白表达容量进而改造利用上的重要性和价值。
因此,酵母木质纤维素产醇体系里的几个关键要素—酵母细胞、异源蛋白及其表达和反应理化因子,都存在UPR响应问题。要实现高效的发酵产醇,仅仅关注其中一个要素是不够的,各要素间的交互效应和综合作用更重要。而长期以来的相关研究则很少关注从UPR响应和调控的角度去考察。要研究这些要素间在UPR响应上的交互效应和综合作用,需要首先建立方便、快速、准确检测和量化UPR响应的方法。本文报导了其中基于β-半乳糖苷酶Lac Z(β-galactosidase)的UPR响应指示菌株的构建,以及这些菌株对酸、醇及β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)表达的UPR响应评价的初步结果。
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