3.3. 6L搅拌式生物反应器中的混养微藻生长及油脂回收
在6L搅拌式生物反应器中进行的TS、SW和MBM微藻生长曲线显示，直到第三天呈指数增长，之后生物质产量保持相当稳定，但TS例外，其从第3天到第4天进一步增加（图3a）。图3b显示了6L搅拌生物反应器中混养培养小球藻4天过程中SW和TS的外观变化。MBM、SW和TS的生物质产量分别为8.0、6.3和9.8 g·L⁻¹，生物质生产率分别为2.0、1.6和2.5 g·L⁻¹·d⁻¹。TS上最高的细胞浓度可能是由于与MBM和SW相比，TS中可代谢糖的浓度更高。据报道，小球藻能够代谢多种单糖（葡萄糖、果糖、半乳糖和甘露糖）以及二糖（乳糖和蔗糖），然而，不同糖中的生长速率和生物质浓度差异很大。葡萄糖和甘露糖是最佳碳源，其次是果糖。有趣的是，本研究结果也表明，葡萄糖含量高于SW的TS支持更高的微藻生长速率。此外，TS中存在果糖（SW中不存在）以及蔗糖，使其相对于SW和MBM具有优势，从而产生更高的最终细胞浓度。
如图3c所示，SW中的单糖，即葡萄糖、半乳糖和果糖，在早期生长期（第0天至第2天之间）被消耗，而二糖蔗糖和寡糖水苏糖仅在第2天后被分解和利用。图3d说明了微藻生长过程中TS中可溶性糖浓度的变化。与SW观察结果类似，TS中的单糖如葡萄糖和果糖在第2天前被消耗，之后微藻细胞代谢麦芽糖、甘油和其他寡糖。
TS中酸（乳酸和乙酸）和甘油的浓度在前24小时被发现增加，然后稳步下降至培养期结束（第4天）。可能的解释是，在微藻细胞生长早期阶段，优先消耗简单糖作为碳源，而不是酸和甘油。小球藻对甘油的代谢已在过去得到证实。在生长后期容易获得的糖耗尽后，可能触发了微藻代谢的转变，细胞开始代谢甘油和酸作为碳源，同时代谢更复杂的糖。
培养液中的总可溶性氮（TN）从培养期的第1天到第2天急剧下降，这对应于微藻细胞的对数生长期。生长曲线末期TN浓度的轻微升高可能是由于死亡微藻细胞胞内物质的释放。当培养基（SW和TS）中的氮含量达到最低浓度（<0.5 g·L⁻¹）时，微藻生长达到静止期，如图3e和f所示。在此阶段，细胞中的油脂含量被发现上升，可能是对胁迫条件的反应。TS和SW中从第3天到第4天相对恒定的总氮浓度（约0.5 g·L⁻¹）表明残留氮可能对微藻细胞不可利用。SW和TS中可能有一些对TN浓度有贡献的有机化合物无法转化为铵态氮并被微藻同化。类似观察也在使用牛粪作为小球藻生长培养基的研究中报道。
在培养期结束时，TS和SW的SCOD分别被发现降低了45%和29%（图3e和f）。然而，微藻生长导致的有机物含量降低不足以允许在不进一步处理的情况下排放TS和SW废水。在微藻生长和收获后，废水TS被发现含有可忽略的油脂含量。
在三种培养基上生长的微藻细胞中的油脂含量（wt.%）在第4天被发现最高，尽管MBM和SW的油脂产量/生产率在第3天最高，而TS在第4天最高（图3a）。这是由于这些天微藻细胞更高的生物质产量/生产率。从MBM、TS和SW来源的微藻生物质中回收的总脂质分别占细胞干重的27%、43%和11%。TS的生物质产量和生产率（9.8 g·L⁻¹，2.5 g·L⁻¹·d⁻¹）在三种底物中最高，因此TS的油脂生产率也最高（1.1 g·L⁻¹·d⁻¹）。小球藻在TS、SW和MBM上生长时的生物质和油脂产量比较见表2。图4显示了在TS和SW上生长不同时间间隔的小球藻显微照片，表明细胞数量增加与培养期长度相对应。
表2 在6L搅拌式生物反应器中MBM、SW和TS上培养的小球藻的生物质和油脂生产率。细胞在混养条件下培养4天，28°C，180 rpm搅拌，0.7 SLPM和pH 6.8。数据为平均值±标准差，n=3。
| 生长培养基a | 生物质 | 油脂 | |||
| 产量 (g·L⁻¹) | 生产力 (g·L⁻¹·d⁻¹) | % (g油/100g生物质) | 产量 (g·L⁻¹) | 生产力 (g·L⁻¹·d⁻¹) | |
| 改良基础培养基 | 8.0 ± 0.2 | 2.0 ± 0.05 | 27 ± 1.0 | 2.2 ± 0.09 | 0.6 ± 0.05 |
| 大豆乳清 | 6.3 ± 0.1 | 1.6 ± 0.03 | 11.1 ± 1.1 | 0.63 ± 0.08 | 0.2 ± 0.02 |
| 稀酒糟 | 9.8 ± 0.3 | 2.5 ± 0.08 | 43 ± 1.2 | 4.2 ± 0.3 | 1.1 ± 0.1 |
图3. （a）在6L搅拌式反应器中MBM（改良基础培养基）、SW（乳清）和TS（稀酒糟）上培养的小球藻的生物质和油脂产量。细胞在混养条件下培养4天，28°C，180 rpm，0.7 SLPM（标准升/分钟）通气速率和pH 6.8。数据为平均值±标准差，n=3。（b）6L搅拌式反应器中SW（乳清）和TS（稀酒糟）上小球藻的混养批次培养。细胞在混养条件下培养4天，28°C，180 rpm，0.7 SLPM通气速率和pH 6.8。（c）6L搅拌生物反应器中小球藻生长过程中SW（乳清）中糖浓度的变化。细胞在混养条件下培养4天，28°C，180 rpm搅拌，0.7 SLPM通气速率和pH 6.8。数据为平均值±标准差，n=3。（d）6L搅拌生物反应器中小球藻生长过程中TS（稀酒糟）中糖浓度的变化。细胞在混养条件下培养4天，28°C，180 rpm搅拌，0.7 SLPM通气速率和pH 6.8。数据为平均值±标准差，n=3。（e）6L搅拌生物反应器中小球藻生长和油脂生产过程中SW（乳清）中总氮和SCOD浓度的变化。细胞在混养条件下培养4天，28°C，180 rpm搅拌，0.7 SLPM通气速率和pH 6.8。数据为平均值±标准差，n=3。（f）6L搅拌生物反应器中小球藻细胞生长和油脂生产过程中TS（稀酒糟）中总氮和SCOD浓度的变化。细胞在混养条件下培养4天，28°C，180 rpm搅拌，0.7 SLPM通气速率和pH 6.8。
图4. 在6L搅拌生物反应器中TS和SW上生长不同时间间隔的小球藻（100×10×放大倍数）显微照片。
3.4. 生物反应器中混养小球藻细胞的化学组成
各种生物质样品的近似分析表明，小球藻细胞的化学组成取决于所使用的营养生长培养基。在TS中生长的细胞比在SW中生长的细胞具有更高的脂肪百分比，而在SW中生长的细胞具有更高的蛋白质和碳水化合物含量（表3）。在TS中生长的细胞观察到的更高油脂含量可能是由于可代谢糖的浓度更高以及氮缺乏，同时TS中含有油脂（约0.5%，w/v），而SW中不含。来源于TS和SW的富含蛋白质微藻生物质作为动物饲料可能具有高价值。油脂提取后的生物质中的碳水化合物可以发酵生产乙醇，或者生物质可以通过热解或气化发电。
表3 在6L搅拌生物反应器中SW（乳清）和TS（稀酒糟）上生长的小球藻细胞的化学组成。细胞在混养条件下培养4天，28°C。数据为平均值±标准差，n=2。
| 成分 (%) (干基) | 在稀酒糟上生长的细胞 | 在大豆乳清上生长的细胞 |
| 水分 | 4.49 | 4.99 |
| 灰分 | 9.16 | |
| 总碳水化合物 | 6.64 | 15.48 |
| 淀粉 | 2.62 | 5.67 |
| 纤维 | <0.01 | <0.01 |
| 可溶性糖 | 5.02 | 9.81 |
| 总脂肪 | 32.76 | 8.95 |
| 总蛋白质 | 40.47 | 50.6 |
3.5. 微藻油脂提取的优化
在微藻培养的诸多挑战中，如菌株选择与开发、培养、收获、脱水、细胞破碎和油脂提取等，细胞破碎步骤尤为关键，因为微藻细胞壁通常较厚。小球藻的细胞壁主要由蛋白质和糖类组成，阻止了胞内脂质的轻易释放。在测试的三种细胞破碎程序中，磁搅拌和旋转混合需要近12小时才能产生与超声方法在3分钟内从微藻生物质中获得的相同油脂产量（TS为4.2 g油/L，SW为0.7 g油/L）。超声也比改良Folch方法更快，后者需要在溶剂添加前进行匀浆步骤和约4小时的混合/接触时间。使用标准Folch方法的油脂产量平均约为TS每升4.1 g油和SW每升0.64 g油，与超声-溶剂方法获得的产量相当接近。这表明超声在破碎微藻细胞壁和释放胞内脂质以溶解于溶剂方面是有效的。超声还减小了微藻细胞的粒径，使更大的细胞表面积与有机溶剂接触。为了找到在油脂产量和化学危害之间提供最佳平衡的油脂提取技术，超声与甲苯/甲醇的结果相当有前景。
3.6. 底物特性对微藻油脂脂肪酸组成的影响
微藻油脂的脂肪酸组成被发现随生长培养基的化学特性而变化。如表4所示，在TS上生长的小球藻油脂的脂肪酸组成与TS中玉米油的组成密切相关。也有研究表明，微生物生长培养基中油脂的存在不仅增加微生物细胞中的脂质积累，而且积累的脂质组成反映了油脂来源的碳链长度和结构。在本研究中，三种培养基中，TS含有约0.5%（w/v）的油脂，在TS上生长的小球藻细胞具有最高的油脂含量（43%，w/w）。当小球藻细胞在不含任何油脂的SW和MBM培养基上生长时，细胞的油脂含量较低（分别为11%和27%，w/w）。也有类似观察，发现酵母根据培养基中存在的碳源改变其细胞脂质组成。
本研究中使用的命名法为：从MBM、SW和TS上生长的藻生物质中提取的油脂样品分别称为小球藻-MBM油、小球藻-SW油和小球藻-TS油。我们的分析表明，每种油脂样品都通过存在或不存在一种或多种脂肪酸而与其他样品不同，尽管它们都是由相同的微藻培养物但在不同培养基上产生的。例如，小球藻-SW油样品中的肉豆蔻酸（C14:0）和小球藻-MBM油样品中的花生酸（C20:0）在其他油脂样品中不存在。棕榈油酸（C16:1）在小球藻-SW油中发现浓度高得多，而硬脂酸在小球藻-MBM油样品中相当高。另一方面，多不饱和脂肪酸（PUFA）如亚油酸（omega-6脂肪酸）和亚麻酸（omega-3脂肪酸），也称为必需脂肪酸，在小球藻-TS油（占总FA的52.2%）和小球藻-MBM油（13.3%）样品中含量较高。小球藻-SW油样品也被发现富含亚油酸（33.1%）。这些必需脂肪酸是人类和动物的强制性膳食需求。大多数人类饮食缺乏亚麻酸。PUFA对膳食补充剂和水产养殖有很大需求；TS和MBM来源的微藻油脂可能是此类高价值产品的极好来源。MBM来源的微藻油脂具有最高的饱和脂肪酸百分比（约43%），而TS来源的微藻油脂最低（约16.5%）。这可能表明在农基副产品底物如SW和TS上生长的微藻可能不是非常适合生物柴油应用的原料。相反，在农业废弃物副产品上培养藻类的价值在于从藻生物质中回收高价值成分，例如PUFA、蛋白质等，基于所需应用。
表4 微藻油脂的脂肪酸（FA）组成分析。油脂样品分别从MBM（小球藻-MBM油）、SW（小球藻-SW油）和TS（小球藻-TS油）上生长的小球藻细胞中提取，以及从稀酒糟本身（TS油）中提取。数据为平均值±标准差，n=2。
| 微藻油样品 | 单个脂肪酸 (占总脂肪酸的百分比) | |||
| 小球藻-改良基础培养基油 | 小球藻-大豆乳清油 | 小球藻-稀酒糟油 | 稀酒糟油 | |
| C 14:0 | 未检出 | 2.5 ± 0.2 | 未检出 | 未检出 |
| C16:0 | 22.9 ± 0.2 | 18.7 ± 0.3 | 13.9 ± 0.2 | 14.5 ± 0.2 |
| C16:1 | 2.1 ± 0.0 | 9.8 ± 0.1 | 2.9 ± 0.2 | 未检出 |
| C18:0 | 18.6 ± 0.3 | 7.2 ± 0.3 | 2.5 ± 0.1 | 2.1 ± 0.3 |
| C18:1 | 21.5 ± 0.4 | 19.7 ± 0.1 | 21.4 ± 0.2 | 25.7 ± 0.4 |
| C18:2 | 17.7 ± 0.2 | 33.1 ± 0.1 | 52.2 ± 0.4 | 30.7 ± 0.2 |
| C18:3 | 13.3 ± 0.2 | 4.7 ± 0.2 | 4.1 ± 0.3 | 未检出 |
| C20:0 | 1.3 ± 0.1 | 未检出 | 未检出 | 1.9 ± 0.2 |
4. 结论
在TS和SW中均观察到高浓度微藻细胞生长，其中TS上生长的细胞获得最高的生物质和油脂产量（分别为9.8和4.2 g·L⁻¹）。微藻油脂样品根据生长底物组成的不同而具有不同的脂肪酸组成。油脂显示出PUFA的存在，且细胞富含蛋白质。使用超声与甲苯/甲醇溶剂系统提高了油脂提取效率，缩短了时间并减少了溶剂使用。因此，本研究证明了廉价且易获得的农工业副产品作为混养微藻营养原料的用途，可以减少对淡水和外部营养的需求。
致谢
作者感谢爱荷华州内华达市的Lincolnway Energy和爱荷华州立大学作物利用研究中心（CCUR）分别提供稀酒糟和大豆片。我们感谢食品科学与人类营养学系和CCUR为本研究提供的实验室设施。我们还要感谢Priyanka Chand、David Grewell博士、Venkat Reddy Chintareddy博士、John Verkade博士、Bill Colonna博士、Carol Ziel博士、Mary Rasmussen博士、Zhiyou Wen博士、Yingjun Wang博士、Martin Spalding博士、Byron F. Brehm-Stecher博士和Supriyo Das博士在本研究各个阶段提供的帮助。
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