3. 结果与讨论
3.1. 使用Bioscreen进行小球藻在乳清和稀酒糟中的异养生长
微孔板中的100个孔能够在同一实验中优化多种培养条件，促进更快、更可靠的结果。如图1a所示，微藻生长速率（对数期单位时间内吸光度读数的平均变化）在对照培养基MBM上最快，其次是过滤TS（FTS）和过滤SW（FSW）。然而，最高最终细胞滴度在FTS中实现。FSW与FTS之间以及FSW与MBM之间的生长存在统计学显著差异（p<0.05），而FTS与MBM之间无显著差异（p>0.05）。细胞在MBM上更快达到静止期，可能是由于碳限制，因为MBM中只有葡萄糖作为唯一碳源。FTS中较长的对数期可能是由于存在不止一种可利用的糖（葡萄糖、果糖和麦芽糖）。另一方面，与MBM相比，FTS和FSW中较长的迟滞期可以用微藻对营养的适应时间来解释。由于SW中的大部分碳水化合物是水苏糖、蔗糖和棉子糖等寡糖，简单糖（葡萄糖、果糖和半乳糖）的浓度低得多，因此SW中的最终细胞滴度在三种培养基中最低。尽管发现小球藻能够代谢水苏糖（如第3.3节所述），但速率相对较低。混合底物利用是微生物代谢的一个重要方面，它决定了微生物在复杂培养基中的生长速率。小球藻在FTS和FSW中的生长曲线显示出双相模式（图1a），表明微藻细胞在简单糖耗尽后从简单碳源向更复杂碳源的代谢转变。类似的生理行为已在褐藻中报道。生物反应器中微藻生长过程中TS和SW中各种糖浓度的变化通过HPLC测量，将在第3.3节中讨论。
3.1.1. 灭菌方法和pH的影响
采用的培养基灭菌方法显著影响SW上的微藻生长，但对TS无显著影响。通过高压灭菌预处理SW产生的细胞密度显著高于过滤灭菌（p<0.05）。高压灭菌TS（ATS）与FTS之间无显著差异（p>0.05）（图1b），而图1c显示高压灭菌SW（ASW）与FSW之间的微藻细胞密度存在显著差异（p<0.05）。已知大豆含有蛋白酶抑制剂，可能通过抑制微藻细胞的蛋白酶来阻止蛋白质同化。然而，两种最突出的大豆蛋白酶抑制剂（Kunitz抑制剂和Bowman-Birk抑制剂）本质上是蛋白质，已知在热处理（100°C）下会失活。因此，高压灭菌（121°C，15分钟）过程中抑制剂的热变性可能导致ASW中的微藻细胞生长优于FSW。因此，TS和SW在摇瓶和生物反应器研究中均采用高压灭菌。
缓冲ATS和ASW至pH 6.8的磷酸盐缓冲液有助于延长微藻生长曲线的对数期（图1b和c）。在ASW中添加缓冲液后，最终细胞浓度显著增加（p<0.05）。然而，在ATS情况下未观察到显著效应（p>0.05），这是由于乳酸的存在赋予了其固有的缓冲能力。
图1. 使用Bioscreen全自动微生物生长曲线分析仪在MBM（改良基础培养基）、SW（乳清）和TS（稀酒糟）培养基中异养培养小球藻5天的生长情况。（a）小球藻在MBM、TS和SW中的生长：实心圆—MBM，空心圆—FTS，空心三角—FSW；（b）灭菌方法和添加磷酸盐缓冲液至pH 6.8对TS中小球藻生长的影响：星号—带缓冲液的ATS，空心圆—不带缓冲液的ATS，空心菱形—带缓冲液的FTS，实心三角—不带缓冲液的FTS；（c）灭菌方法、葡萄糖补充和添加磷酸盐缓冲液至pH 6.8对SW中小球藻生长的影响：星号—带缓冲液和1%葡萄糖的ASW，实心圆—带缓冲液的ASW，空心三角—不带缓冲液的ASW，空心圆—带缓冲液的FSW，空心方块—不带缓冲液的FSW；（d）葡萄糖和氮（KNO₃）补充对TS中小球藻生长的影响：空心方块—带葡萄糖和KNO₃的FTS，实心圆—带KNO₃的FTS，空心三角—未补充的TS。数据为平均值，n=3。
3.1.2. 营养补充的影响
向ATS和ASW补充0.5%至3%（w/v）的葡萄糖导致微藻生长速率和最终细胞浓度显著升高（p<0.05）。然而，将糖含量增加到3%临界浓度以上并未进一步提高生物质产量。事实上，4%及以上的葡萄糖浓度导致较低的细胞滴度，可能是由于底物抑制。向ATS补充KNO₃观察到细胞浓度显著升高（p<0.05）和对数期延长（图1d）。在未补充和补充KNO₃的ATS中，细胞分别在约85小时和100小时后达到静止期。这表明在未补充ATS中约80–85小时微藻生长后出现氮限制。在ASW中未观察到类似现象，可能是因为细胞由于氮和可利用碳的限制而进入静止期，需要同时补充KNO₃和葡萄糖才能延长对数期。
这些信息对微生物油脂生产至关重要，因为已知微藻在氮限制或胁迫条件下，在有可利用糖源存在时会合成更多的储存脂质。氮限制已知会胁迫细胞减少蛋白质合成和生长。因此，产油微藻细胞同化的过量碳和能量被引导至更高的胞内油脂生产。储存脂质主要是三酰甘油，与碳水化合物相比是更有效的能量储备，在胁迫后细胞复苏期间能更好地发挥作用。
3.2. 摇瓶中异养和混养生长及油脂生产的比较
摇瓶研究表明，对于研究的三种培养基，混养条件下的生物质产量显著高于异养条件（p<0.05）。MBM在混养和异养条件下的生物质产量分别为7.1和5.6 g·L⁻¹。SW的生物质产量分别为5和2.5 g·L⁻¹，而TS在混养和异养条件下的生物质产量分别为8.3和5.8 g·L⁻¹。混养条件下更高的细胞密度可能是由于有氧呼吸与培养基中碳水化合物的分解代谢以及光合作用相结合提供的更高能量可利用性。光和有机底物之间的协同作用已有报道。与异养细胞的黄色相比，混养细胞呈现淡绿色（图2b），进一步证实了混养条件下微藻细胞的光合活性。
图2. （a）在MBM（改良基础培养基）、SW（乳清）和TS（稀酒糟）中培养的小球藻的生物质和油脂产量。在250 mL锥形瓶中进行批次培养4天，28°C，150 rpm搅拌，异养和混养条件。数据为平均值±标准差，n=3。（b）SW（乳清）和TS（稀酒糟）中小球藻的异养和混养生长。批次培养4天，28°C，150 rpm搅拌。混养细胞在恒定荧光灯下培养，而异养细胞在黑暗中培养。注意绿色混养细胞与黄褐色异养细胞之间的颜色差异，表明混养细胞具有光合活性。
通过将细胞中的油脂含量（wt.%）与生物质产量（g·L⁻¹）相乘计算油脂产量（g·L⁻¹）。发现混养微藻细胞具有更高的油脂含量，因此产生比异养细胞更高的油脂产量（图2a）。也有报道指出小球藻在混养条件下具有更高的油脂生产率，并建议增加碳的可利用性可能导致储存脂质比例增加。在混养生长中，由于细胞的能量需求主要由光合作用满足，营养培养基中的过量碳可能被更多地导向胞内油脂储存。主动运输被报道为藻类从环境中同化有机碳底物的主要方式，这种运输系统似乎受许多微藻物种中辐照度的调节。在低辐照度下，这些细胞已被证明能够整合一系列有机碳化合物，包括丙酮酸、乙酸盐、乳酸盐、乙醇、饱和脂肪酸、乙醇酸盐、甘油、己糖和氨基酸，作为储存物质来补贴其光合代谢。在本研究中，混养细胞暴露于恒定低辐照度（880 lx），并同时提供多种碳源。低光强度可能作为胁迫信号作用于细胞，促使它们将培养基中过量可利用的糖转化为储存脂质并最小化细胞分裂。这种胁迫适应现象类似于在其他藻类中观察到的氮限制和油脂产量增加。
备注：SW（乳清）
TS（稀酒糟）
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