摘要
革兰氏阴性菌嗜麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）存在于多种生态位中。由于其强大的生物膜形成能力和对多种抗生素的耐药性，该菌也是一种院内病原菌，对免疫系统受抑制或受损的患者健康构成严重威胁。除了组氨酸激酶RpfC之外，双组分信号转导系统（TCS）是大多数细菌病原体使用的典型调控机制，但从未在嗜麦芽寡养单胞菌中进行过实验研究。本文中，我们在嗜麦芽寡养单胞菌基因组中注释了62个推定的组氨酸激酶基因，并通过系统性插入失活成功获得了51个突变体。表型鉴定发现了一系列在细菌生长、游动能力和生物膜发育方面存在缺陷的突变体。一个名为BfmA-BfmK(Smlt4209-Smlt4208)的TCS，通过遗传学方法被证实可调控嗜麦芽寡养单胞菌的生物膜形成。结合相互作用伙伴预测和染色质免疫沉淀筛选，我们鉴定出六个在体内被BfmA结合的候选启动子区域。我们证明，其中BfmA作为一个转录因子，直接结合bfmA-bfmK操纵子和Smlt0800(acoT)的启动子区域，并正向调控它们的转录。acoT是一个编码与生物膜发育相关的酰基辅酶A硫酯酶的基因。对组氨酸激酶基因进行基因组规模的突变分析以及对生物膜中BfmK-BfmA调控的功能解析，为支持更深入研究嗜麦芽寡养单胞菌的细胞信号传导提供了遗传信息，从而为开发对抗这一重要细菌病原体的新方法奠定基础。
组氨酸激酶（HK）是双组分信号转导系统（TCS）的组成部分，被大多数细菌用来检测和响应环境刺激。除少数细菌物种（如支原体属）外，细菌细胞通常编码几个到数百个TCS，所拥有的TCS总数是细菌适应各种生态位能力的比喻，即细菌的“智商”。典型的TCS由一个膜结合的HK和一个胞质应答调节因子（RR）组成。在监测到特定刺激后，HK通过水解ATP使自身发生自磷酸化，并将磷酸基团转移至其二聚化和组氨酸磷酸转移（DHp）结构域内的一个保守组氨酸残基。接着，磷酸基团被转移至其同源RR的N端接收结构域内的一个保守天冬氨酸残基。此后，激活的RR根据其C端输出结构域的生化特性，控制下游基因表达、细胞行为或酶活性。因此，细菌在复杂环境中生存的能力在很大程度上取决于其HK库的数量、结构和调控功能。在感染的背景下，一些HK（例如PhoQ、QseC和SaeS）充当细菌病原体毒力因子表达的典型调节因子。TCS由原核生物、粘菌、真菌和植物的基因组编码。然而，在动物的任何蛋白质组中均未发现TCS。因此，HK可能是开发针对细菌病原体的新型抗生素的理想分子靶点。
在过去的30年里，革兰氏阴性病原菌嗜麦芽寡养单胞菌已逐渐成为免疫功能低下疾病患者或医院中长期使用抗生素治疗患者的重要机会性病原菌。这种病原体在此类免疫功能低下患者中引起致命性疾病，如肺炎、尿道炎、脑膜炎和血流感染。治疗嗜麦芽寡养单胞菌感染的困难之一在于，该菌的大多数分离株具有在灌注管、留置血管内装置、医疗器械、水管和宿主组织等表面形成生物膜的强大能力。这些细菌聚集体是感染源，并且很难有效清除。此外，嗜麦芽寡养单胞菌基因组编码多种多药外排泵和其他分子机制，增强了该菌对各种抗生素的耐药性。由于这些原因，嗜麦芽寡养单胞菌已成为人类健康的严重威胁。一些研究估计，在报告的院内感染病例中，高达77%的死亡率可能归因于嗜麦芽寡养单胞菌感染。为了对抗嗜麦芽寡养单胞菌，需要开发基于靶向生物膜形成和毒力因子表达调控的新疗法或抗菌剂。然而，TCS调控这一潜在可作为新型抗菌剂靶点的核心分子机制之一，在嗜麦芽寡养单胞菌中缺乏适当的研究。实际上，只有负责近缘细菌黄单胞菌属（Xanthomonas spp.）中细胞间通信和毒力因子表达的HK RpfC，已被证明可控制嗜麦芽寡养单胞菌中扩散性信号因子（DSF）触发的调节。我们之前的研究鉴定出FsnR，一个控制鞭毛基因转录和生物膜形成的孤儿RR，但FsnR的同源HK仍不清楚。
在本研究中，我们对嗜麦芽寡养单胞菌所有参与控制生物膜形成的HK基因进行了系统的突变研究。在62个推定的HK基因中，我们使用载体整合方法通过同源单交换事件获得了51个插入突变体。表型鉴定发现了一系列参与细菌生长、游动能力和生物膜发育的HK基因。其中，一个由双顺反子操纵子编码的TCS，命名为BfmA-BfmK(Smlt4209-Smlt4208)，通过遗传学方法被证实可调控细菌细胞聚集。BfmK是一个真正的HK，具有自激酶活性，而BfmA作为一个转录因子，结合bfmA-bfmK操纵子的启动子区域以自动调节其自身表达。此外，BfmA结合Smlt0800的启动子区域以正向调控其转录。该基因编码一个酰基辅酶A（acyl-CoA）硫酯酶（命名为AcoT），其过表达可部分恢复bfmA突变体中的生物膜缺陷。对嗜麦芽寡养单胞菌HK基因的基因组规模突变分析以及对生物膜中BfmK-BfmA调控的功能解析，为嗜麦芽寡养单胞菌的HK提供了遗传信息，以促进未来对这种细菌病原体细胞调控的研究。
材料与方法
菌株、质粒和生长条件。本研究中使用的菌株和质粒列于表1。嗜麦芽寡养单胞菌ATCC 13637在28°C的NYG培养基（5克/升胰蛋白胨，3克/升酵母提取物，20克/升甘油；pH 7.0）中培养。嗜麦芽寡养单胞菌感受态细胞通过在210培养基（4克/升酪蛋白酶解物，5克/升蔗糖，3克/升K₂HPO₄，0.3克/升MgSO₄·7H₂O；pH 7.0）中培养细菌来制备；通过离心（12,000×g）收集细胞，并用冰浴的10%甘油洗涤三次。用于分子克隆的大肠杆菌DH5α细胞通常在37°C的LB培养基中培养。抗生素使用以下浓度：卡那霉素，50微克/毫升；氨苄青霉素，100微克/毫升；壮观霉素，100微克/毫升；链霉素，200微克/毫升。通过电穿孔（18和200Ω）使用Bio-Rad Pulser Xcell电穿孔系统（Bio-Rad，美国）实现嗜麦芽寡养单胞菌和大肠杆菌的转化。
分子克隆和菌株遗传操作。插入失活突变体（通过同源单交换方法）和框内缺失（通过同源双交换方法）嗜麦芽寡养单胞菌突变体分别使用自杀载体pK18mob和pK18mobsacB构建，如先前报道。用于扩增相关DNA序列的引物列于表2。插入失活突变体在含有卡那霉素的NYG平板上筛选，框内缺失突变体在含有10%蔗糖的NYG平板上筛选。为了构建点突变，根据产品手册使用Fast Mutagenesis System（Transgene，中国）。常用的分子克隆方法，如PCR、连接和DNA限制性内切酶消化，按照《分子克隆：实验室手册》中的说明进行。
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