微生物学实验对医学生来说是一门非常重要的专业基础课,也是一门实用性很强的工具课。物理化学因素对细菌生长的影响是我们开设的微生物学实验之一,目的是希望学生掌握物理因素如紫外线、化学因素如各种消毒剂和药物对细菌生长的影响,为以后学习细菌的消毒灭菌打下基础。试验在教学中取得了良好的实验效果。同时,我们也发现了一些特殊的现象,并进行了初步探索。


1试验方法


1.1物理因素对细菌生长影响试验


用紫外线照射细菌的方法进行物理因素对细菌生长影响试验,详细操作方法如下:用无菌棉签蘸取金黄色葡萄球菌菌液少许,轻轻地在无菌的琼脂平板上均匀涂布,涂满整个平板;把琼脂平板放在无菌超净台中,打开三分之二皿盖,开启紫外灯管照射30 min;30 min后,将培养皿皿盖盖好,从无菌超净台中取出放入37℃温箱中培养18~24 h后观察结果。


1.2化学因素对细菌生长影响试验


化学因素对细菌生长影响试验,用各种消毒剂和药敏片作为试剂进行试验。用消毒剂对细菌影响的试验,操作方法如下:①制作滤纸片。取滤纸一张,用打孔器打孔,制备成干燥滤纸片备用。②浸取消毒剂。把滤纸片浸入各种消毒剂中。③涂菌。在无菌超净工作台中,在培养基中加入1 ml金黄色葡萄菌培养物,用无菌涂棒均匀涂布。要求涂布均匀致密。④放入蘸取消毒剂的滤纸片。用无菌镊子夹取浸有消毒剂的滤纸片,放于培养基中。⑤记录。记录各种消毒剂名称。⑥温箱培养。将贴好消毒剂片的培养皿置于37℃温箱中培养18~24 h。


各种药敏片对细菌生长影响实验,是消毒剂对细菌生长实验的进一步延伸。消毒剂影响试验中,只能看到各种消毒液对细菌的杀伤作用;而药敏试验中,根据国家标准能判断出敏感和耐药。具体操作如下:涂菌;放入药敏片;涂菌;放药敏片。为了避免抑菌圈互相重叠,影响测量抑菌圈直径,需要将药敏片均匀分布于培养基表面,记录并放温箱培养。


2试验结果


在紫外线杀菌试验中,经紫外线照射30 min、培养24 h后,被皿盖遮住的琼脂表面菌苔呈半圆形生长,暴露于紫外灯下的部分无细菌生长,界限较为清晰。随着对菌液的继续培养,界限开始不太清楚,有些照射过紫外线的地方也开始有细菌菌落,而且菌落相对较大,见图1。


在消毒剂对细菌影响试验中,不同的消毒剂作用于细菌产生的透明圈大小不一。学生在第二天观察实验结果时发现,其他消毒剂都有明显的透明圈,但酒精滤纸片没有透明圈或是透明圈上明显有一层细菌生长。

图1紫外线对细菌生长影响实验结果


在各种药敏片对细菌生长影响试验中,各类药敏片上的药物对金黄色葡萄球菌的杀伤力有差异,从而出现大小不一的透明圈。在多次试验中发现一种现象:不同药物形成不同大小的透明圈,但是透明圈的边缘有的清晰有的模糊,见图2。

图2不同的抑菌环


3分析与讨论


紫外线杀菌[1-2]主要是作用于细菌的DNA,使DNA双链中一条链上相邻的两个嘧啶形成二聚体。形成的二聚体干扰DNA的复制与转录过程[3],由于抑制了细菌的复制,较轻的后果是使微生物发生突变,严重的情况会造成微生物死亡。生物体为对抗这种紫外线的辐射损伤,其细胞内存在着各种各样的修复和保护机制,如:把放线菌放到紫外灯下照射,然后再置于强烈的可见光下培养,可以使更多菌株存活。菌株经过强光照射后,可产生一种酶,帮助修复菌株受损的DNA[4]。而且紫外线灭菌的效果和菌液的薄厚、时间的长短、灯管距离的远近都有关系[5]。


在消毒剂对细菌生长影响试验中,消毒剂对细菌有杀伤作用,所以形成不同的透明圈。酒精浸泡的滤纸片没有透明圈,或者透明圈上有一薄层细菌生长,原因是:培养基上放置各个消毒剂滤纸片后,要放到温箱培养,而培养箱温度为37℃,酒精本来就容易挥发,在如此高温下,挥发的速度加快,还没有损伤到细菌之前已经挥发殆尽,对细菌不能造成损伤,导致无透明圈出现,或者透明圈照样有细菌生长。


在药敏试验中,不同药物形成不同的透明圈,有的透明圈边缘整齐,有的透明圈边缘模糊,没有明显的界限,见表1。

表1不同药物形成的透明圈特点


杀菌药物沿培养基扩散后直接将处于静止期和生长期的细菌杀死,细菌不能再通过自我修复存活,所以产生的透明圈边缘清楚。抑菌药物沿培养基扩散后对生长的细菌有很大的杀伤作用,但是对于静止期的细菌而言,只起到抑菌的作用,细菌还有一定的生命力,还可以小量生长繁殖,这样,透明圈的边缘就会有小部分细菌生长,从而形成模糊的边缘。


对不同区域内金黄色葡萄球菌进行革兰氏染色[8]并用油镜观察,模糊边缘处的细菌一部分已经恢复到正常状态,呈典型细菌性状,染色阳性;有一部分染色呈阴性,推想细菌细胞壁已经被药物破坏;透明区内没有观察到典型细胞形态,说明细菌已经死亡崩解。


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