2.3. 优化和生物动力学评估
由于pH和温度一直是深层培养中各种食用菌菌丝体产量最大化的关键变量，因此研究了与这两个参数同时变化相关的灵芝菌丝体生长。应用响应面分析（RSA）来优化影响生长的因素（即温度和pH）。在本实验中，"最优条件"是指在独立变量研究空间内最大化菌丝体产量的操作条件。采用顺序收集数据、估计多项式（公式(1)）和检验模型充分性的程序：
η = c₀ + Σαᵢxᵢ + Σαᵢᵢxᵢ² + ΣΣαᵢⱼxᵢxⱼ (1)
其中η为菌丝体浓度的实验值（g/l），xᵢ为独立变量i（按顺序为pH和温度），c₀为回归常数，αᵢ为独立变量i的回归系数（按顺序为pH和温度）。使用最小二乘法估计近似多项式中的参数。本研究采用中心复合立方体（CCC）设计，该设计由正交的2²析因设计加上中心和2×2轴点组成。在最优条件下的分批发酵数据用于评估灵芝的系统性能和生长动力学。我们使用底物抑制生物动力学表达式描述微生物生长和底物利用，数值近似公式如下：
Xₜ₊₁ = [1 + (µₘSₜ)/(Kₛ + Sₜ + (Sₜ²/Kₛᵢ)) - kᵈ]Δt Xₜ (2)
Sₜ₊₁ = [1 - (µₘY Xₜ)/(Kₛ + Sₜ + (Sₜ²/Kₛᵢ))Δt] Sₜ (3)
| 试验 | 变量条件 | 响应值 | ||
|---|---|---|---|---|
| pH | 温度 (°C) | 菌丝体干重 (g/l) | 残余SCOD浓度 (g/l) | |
| 1 | 3.5 | 25 | 14.3 | 6.8 |
| 2 | 4.5 | 25 | 16.5 | 4.1 |
| 3 | 3.5 | 35 | 13.4 | 10.3 |
| 4 | 4.5 | 35 | 15.1 | 7.8 |
| 5 | 4.0 | 30 | 17.0 (0.5) | 4.5 (0.8) |
| 6 | 4.0 | 37.1 | 14.0 | 8.5 |
| 7 | 4.0 | 22.9 | 15.8 | 6.2 |
| 8 | 4.7 | 30.0 | 16.3 | 4.6 |
| 9 | 3.3 | 30.0 | 14.3 | 8.9 |
注：括号中的数值指标准偏差。试验5为中心点，实验重复五次，响应值取平均值。
其中Xₜ为时间t时生物反应器中的微生物浓度（微生物质量/体积），µₘ为最大比生长速率（时间⁻¹），Sₜ为时间t时的残余底物浓度（底物质量/体积），Kₛ为半饱和系数，数值上等于比生长速率为其最大值一半时的底物浓度（底物质量/体积），Kₛᵢ为底物抑制系数（底物质量/体积），kᵈ为微生物的比衰减速率（时间⁻¹），Δt为时间增量（时间），Y为微生物产率系数（微生物质量/利用的底物质量）。采用四阶龙格-库塔近似法以及多响应非线性最小二乘法（NLLS）估算具有95%置信区间（CI）的动力学系数。
2.4. 分析方法
乳清和发酵罐混合液的COD采用密闭回流比色法测定。使用两台相同的离子交换色谱仪（790，Metrohom）定量样品中的阳离子和阴离子。使用配备折射率检测器的高效液相色谱仪（HPLC 1100系列，Agilent）定量乳糖。在每个稳定生长期取样，使用Whatman 2号滤纸过滤，在103°C下干燥以测量自由悬浮培养中菌丝体干物质的浓度。培养基中的总多糖通过苯酚-硫酸法测定。蛋白质含量根据凯氏定氮法测定。使用全自动微生物生长曲线分析仪（Bioscreen C，Labsytems）估计不同底物浓度下的菌丝体生长速率以验证模型准确性。
3. 结果与讨论
3.1. 利用乳清优化灵芝菌丝体生产
图1 菌丝体产量二次模型对pH和温度的二维和三维等高线图
共进行了13次试验来近似灵芝菌丝体产量的响应面。初始底物浓度为53.0 g/l可溶性COD（SCOD）。在所有试验中，氮的最低观测值为40 mg/l NH₄⁺，磷为250 mg/l PO₄³⁻，表明这些必需营养物质不受限制。为了找到响应的最大值，依次用试验检验了一阶到部分立方模型。同时检验了回归、失拟和相应系数的P值。如果多个模型在统计上显著描述响应，则同时分析残差方差和图以区分模型。二次模型的回归在1% α水平上显著，失拟在5% α水平上不显著，该模型为：
η = -9.1 × 10⁴ + 3.3 × 10⁴x₁ + 2.7 × 10³x₂ - 52x₁x₂ - 3.7 × 10⁴x₁² - 44x₂² (4)
二次模型的回归系数和残差标准差分别为0.95和0.4。这表明在实验区域内菌丝体干重的响应面存在曲率。通过将函数对相应独立变量pH和温度的偏导数设为零，计算出菌丝体产量的最优条件，分别为pH 4.2和28.3°C。在最优条件下计算的模型输出为18.1 ± 0.9 g/l干重。菌丝体产量二次模型的二维和三维响应面及估计最优值如图1所示。菌丝体产量对pH和温度的响应面显示出具有恒定等高线的明显峰值。这意味着两个独立变量不相互依赖，且它们对利用乳清培养灵芝菌丝体产量的联合效应不显著。
将优化菌丝体产量时应用的相同方案分别应用于近似稳定生长期残余SCOD浓度的响应面。基于统计显著性，选择部分立方模型：
SCOD = -309752 + 169858x₁ + 13652x₂ - 7534x₁x₂ - 19837x₁² - 7x₂² + 16x₁x₂² + 821x₁²x₂ (5)
来描述响应面。在设计范围内，SCOD去除率为80.7%至93.1%，其中最大SCOD去除的条件为pH 4.6和27.1°C。估计条件下的模型响应为3.6±0.6 g/l SCOD，即93.1%的SCOD降低。使用公式(5)，菌丝体产量最优条件下的残余SCOD浓度为3.8 g/l，接近最小值。这表明该椭圆区域的梯度不陡，因此菌丝体产量的最优条件可能可用作整体工艺参数，以在几乎最大降低SCOD浓度的同时最大化利用乳清培养灵芝的菌丝体产量。
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