摘要
在微藻商业化培养的诸多挑战中，低成本水和养分的可获得性至关重要。本研究旨在测试和优化两种农工业副产品——干法乙醇稀酒糟（TS）和乳清（SW）——作为混养/异养微藻培养的营养原料。首先在Bioscreen全自动微生物生长曲线分析仪和250mL锥形瓶中对小球藻的异养生长进行优化，然后放大至6L搅拌式生物反应器。通过超声和溶剂萃取处理从干燥的微藻生物质中提取胞内油脂以进行产率比较和脂肪酸分析。在生物反应器中混养条件下培养4天后，TS、SW和改良基础培养基（MBM）的生物质产率（干基）分别为9.8、6.3和8.0 g·L⁻¹，油脂含量分别为43%、11%和27%（w/w）。油脂样品的脂肪酸组成被发现随培养基特性而变化。在TS和MBM上生长的小球藻分别产生富含亚油酸和亚麻酸的油脂。本研究强调了两种农工业副产品作为微藻生长培养基的潜力，并可同时生产高价值微藻油脂。
1. 引言
微藻是人类多种有用产品的来源，包括碳水化合物、必需脂肪酸、色素、食品补充剂、肥料、药品和生物燃料；目前正在开发更经济的大规模培养方法。水和养分的可获得性是藻类养殖面临的若干挑战之一。已知异养和混养藻类的生长速度远快于光自养细胞，且细胞油脂含量更高，适合作为生物燃料原料。然而，它们需要葡萄糖或乙酸盐等有机碳源进行生长，这些占培养基成本的80%。为了降低微藻生产成本，必须找到能够满足产油藻类营养需求的廉价有机底物。已有一些研究使用木薯淀粉水解物和玉米粉水解物作为葡萄糖替代品，获得了更高的油脂产量。关键在于在降低培养基成本的同时，将油脂产量和生长速率维持在接近葡萄糖培养的水平。本研究考察了两种农工业副产品——TS和SW——作为微藻生长培养基的能力。
大豆粕的湿法加工常用于生产大豆分离蛋白，用作能量补充剂和食品配料。SW是大豆蛋白从脱脂大豆片粗提液中等电沉淀（pH 4.5）后剩余的液体。大量这种液体废物需要能耗密集的浓缩步骤，最终被丢弃，导致严重的废物处理问题。因此，对该副产品流进行增值利用对于减少污染和最大化资源利用是必要的。干基SW通常含有3.6–4.4%的氮（其中50%为蛋白氮）、25–35%的可溶性糖，以及大量的磷、矿物质和多种对微藻生长至关重要的微量元素。在一项相关研究中，我们利用SW作为培养基来培养挑剔的乳酸菌。我们假设SW的高营养含量也能支持微藻生长。
本研究使用的第二种微藻生长培养基是TS，来自干法玉米乙醇工艺的副产品。每生产1L乙醇约产生5L酒糟。酒糟中含有玉米中大部分营养物质。通过离心将其分离为液体（称为稀酒糟）和固体部分（称为湿酒糟）。部分TS被回用作为磨碎玉米液化的回流液，其余部分则通过多效蒸发器处理，需要大量能量制成称为浓缩可溶物（CDS）的"糖浆"。CDS通常与湿酒糟可溶物或干酒糟可溶物混合，两者都以低利润出售。近来，由于糖浆营养价值低，需求下降，以极低价格出售甚至免费赠送。美国玉米乙醇产量从2007年的6500百万加仑/年翻了一番，到2010年达到13230百万加仑/年，导致酒糟产生量增加。为这一副产品流寻找新应用对于该行业的可持续性和经济可行性至关重要。初步实验表明，微藻细胞无法在TS高固形物存在下生长。在冷藏温度下储存时，TS中的固形物（在6%至8%之间变化）倾向于沉降，留下含有溶解营养的澄清液体。该澄清液体含有高浓度有机物（约50 g·L⁻¹可溶性COD），包括糖、酸、甘油、氮和其他微量营养素，可用作微藻培养的液体培养基。
本研究的目标是：1）在微孔板、摇瓶和6L搅拌式生物反应器水平上优化小球藻在TS和SW上的培养参数以获得最大生长量；2）使用超声和有机溶剂优化油脂提取方法；3）确定培养基特性（SW、TS和MBM）对微藻胞内油脂脂肪酸组成的影响。
2. 材料与方法
2.1. 微生物与培养基
从Carolina Biological Supply Company获得小球藻的纯培养物。微藻培养物在MBM中繁殖和维持，MBM含有：葡萄糖10 g；酵母提取物6 g；KH₂PO₄ 1.25 g；MgSO₄·7H₂O 1 g；EDTA 0.5 g；H₃BO₃ 114.2 mg；CaCl₂·2H₂O 111 mg；FeSO₄·7H₂O 49.8 mg；ZnSO₄·7H₂O 88.2 mg；MnCl₂·4H₂O 14.2 mg；CuSO₄·5H₂O 15.7 mg；Co(NO₃)₂·6H₂O 4.9 mg·L⁻¹。
脱脂大豆片从Cargill, Inc.获得，密封于塑料袋中并在4°C下储存直至使用。脱脂大豆片含有57.3%（干基）粗蛋白，蛋白分散指数为93.8。SW在实验室中按照先前研究描述的方法从脱脂大豆片制备。SW的pH在4.3至4.5之间，使用前调整至约6.8。它含有总氮1210 mg·L⁻¹、粗蛋白7575 mg·L⁻¹、蔗糖7.14 mg·mL⁻¹、水苏糖6.56 mg·mL⁻¹、半乳糖0.84 mg·mL⁻¹和葡萄糖0.74 mg·mL⁻¹。
玉米稀酒糟从爱荷华州内华达市的Lincolnway Energy（一家当地干法玉米乙醇工厂）获得。样品收集于无菌容器中，使用前在4°C下储存一周。新鲜TS的pH在3.8至4.7之间，总悬浮固形物约19 g·L⁻¹。它含有约2.0和1.2 mg·mL⁻¹的乳酸和乙酸；以及4.6 mg·mL⁻¹的甘油，来自酵母发酵。储存一周后，TS中的悬浮固形物发生沉降。沉降TS的上清液含有约0.1 g·L⁻¹的悬浮固形物，被虹吸出来并灭菌后用作微藻生长培养基。TS和TS上清液的化学特性见表1。
表1 稀酒糟和稀酒糟上清液的化学特性。所有数值均为平均值±标准差，n=3。
| 参数 | 稀酒糟 | 稀酒糟上清液 |
|---|---|---|
| pH | 4.2±0.3 | 4.1±0.3 |
| 总悬浮固形物 (g·L⁻¹) | 19±3 | 0.1±0.05 |
| 总溶解固形物 (g·L⁻¹) | 41±3 | 40±2 |
| 总COD (g·L⁻¹) | 80±6 | 45±5 |
| 可溶性COD (g·L⁻¹) | 48±6 | 45±5 |
| 总糖 (g·L⁻¹) | 27±2 | 12±1.5 |
| 总氮 (g·L⁻¹) | 5.5±1.2 | 1.5±0.1 |
2.2. 种子液制备
使用从供应商收到的原始琼脂斜面上的小球藻菌落接种100 mL无菌MBM培养基（pH 6.8），置于250 mL锥形瓶中。将烧瓶置于轨道摇床上，在室温（约25°C）下，恒定荧光灯（照度880 lx）下，以150 rpm的搅拌速度培养3天。向培养基中添加20 μg·mL⁻¹氯霉素以防止培养期间可能的细菌污染。
2.3. 培养条件
使用三种培养系统培养小球藻——1）在自动全自动微生物生长曲线分析仪（Bioscreen）中的微孔板中进行异养生长；2）在200 mL锥形瓶中进行异养和混养批次培养；3）在6L台式搅拌生物反应器中进行混养批次培养。每种培养系统的细节在第2.4–2.6节中描述。
2.4. 微孔板快速生物测定
使用Bioscreen C微生物生长曲线分析仪评估不同培养参数对微藻生长速率的影响。该设备是组合式培养箱和微孔板读数器，能够收集多达200个独立孔（孔容量400 μL）的高分辨率600 nm吸光度数据。通过将小球藻在pH为5、6、6.8、7.5和8的MBM、SW和TS中培养来测试pH效应，通过添加0.1 M磷酸盐缓冲液维持pH。缓冲液浓度为100 mM，通过添加所需量的磷酸一钠和磷酸二钠盐制备所需pH水平。还研究了以葡萄糖、KH₂PO₄和KNO₃形式补充碳、磷和氮源的效果。葡萄糖以不同浓度（0.5至4%，w/v）添加，而KH₂PO₄和KNO₃分别以0.13%和0.24%（w/v）添加。营养液在使用Millipore尼龙膜过滤器（孔径0.2 μm）过滤灭菌后添加到培养基中。还测试了培养基灭菌方法（过滤与加热）对生长产量的影响。过滤灭菌使用孔径0.2 μm的Millipore尼龙膜过滤器，而加热灭菌通过在121°C下高压灭菌15分钟完成。向每个孔中添加270 μL营养培养基和30 μL种子液，其平均初始吸光度在540 nm处约为0.2。将接种的平板置于Bioscreen中，在异养条件下于28°C培养5天。每30分钟记录一次Abs540，每次读数前自动振荡5秒以确保孔内容物充分混合。所有处理均进行五次重复（n=5）。选择在Bioscreen中对应最高细胞密度的培养条件，并在摇瓶中进行放大。