酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是人类第一个应用的微生物,其发酵性能早已被规模化利用。作为最重要的工业微生物与科学研究的模式生物,酿酒酵母在食品、医药、能源化工和环境治理等领域有重要经济应用价值;同时也是模式生物基因组计划(model organism genome project,MOGP)的成员,1996年酿酒酵母S288c基因组测序已全部完成。
生长曲线反映了培养过程中生长和繁殖的规律,同一种酿酒酵母在不同的生长条件下生长曲线也不尽相同,通过生长曲线了解菌体生长繁殖情况,对于根据不同的需要有效地利用和控制酿酒酵母生长具有重要的意义。
测定菌体数量的方法主要有直接血球计数板计数法和间接平板菌落计数法,这些方法都比较繁琐、耗时,所以在实际应用中衡量菌体生长情况多采用简单、快速的分光光度法,在此方法中常用光密度(optical density,OD)来表示菌悬液浓度。除此之外可以利用OD值来评价菌体的生长情况和生物性能,从而进行相关基础研究,利用菌悬液OD值来衡量酿酒酵母对乙醇的耐受性,利用OD值作为度量值来研究高产菌株基因与环境的相互作用。但是对于菌体浓度和OD值之间的确切关系,特别是当菌液浓度较大时,用稀释后的OD值反映菌体浓度等的研究较少。
本研究采用分光光度法测定了酿酒酵母在不同生长条件下的生长曲线,并和平板菌落计数法进行比较。
图1分光光度法测得酿酒酵母不同生长条件下的生长曲线
图2平板菌落计数测得酿酒酵母不同生长条件下的生长曲线
结论
本研究对稀释后的OD值进行分段线性回归,利用回归方程将OD值回归到统一标准上,然后绘制生长曲线,将此与平板菌落计数法绘制的生长曲线进行比较,得出以下结论:2种方法测定生长曲线时在稳定期以前基本一致,在稳定期以后出现明显的差异,前者观察不到衰亡期。后续OD值与菌体细胞数量关系的实验发现,在对数期OD值与菌体细胞数量呈良好的线性关系,稳定期以后不再呈线性,这也就解释了上述生长曲线的差异。
这主要是由于进入稳定期后半段以后细胞死亡率开始大于繁殖率,死亡的细胞逐渐增多,再加上菌体自溶[12-13]都会产生一定吸光值,此时的OD值已经不能反映菌悬液的细胞浓度,所以OD值测得的生长曲线在稳定期以后是不可靠的。但在实际工业生产中,更多关注的是菌体进入对数期的时间或者稳定期以前的情况,所以OD值测生长曲线还是有着重要的应用价值。本研究还利用了OD值与菌体细胞数量在稳定期以前的线性关系,进行了不同OD值与细胞数量的对应关系,此结论对酿酒酵母生产和基础研究中有关菌体数量的测定有着指导性的意义。本实验结果表明,菌悬液OD值与稀释倍数之间并不是线性关系,而呈幂函数关系。
在传统工业生产中,用OD值衡量酿酒酵母的生长过程主要是为了判断是否进入对数期来指导发酵接种。但近年来研究发现,酿酒酵母在不同的生理时期核糖体以及胁迫相关蛋白都不尽相同,这些差异都会反过来影响到其发酵性能,故利用OD值监测酿酒酵母的生长过程,准确定位生理时期对于发酵生产尤为重要。本研究对于利用OD值来评价菌体生长过程的相关结论对于工业生产和生物学研究有着重要一定的参考价值。
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