在化学和物理恒定条件下，毕赤酵母、多形汉逊酵母和谷氨酸棒杆菌的单个细胞表现出的比生长速率始终高于群体培养中的比生长速率。这凸显了通过解耦生理学和细胞外环境进行单细胞分析的重要性，现在使用Envirostat 2.0系统可以实现这一点。
任何涉及微生物细胞的过程的输出都由群体中每个个体细胞的生理活性组成。尽管批量测量的平均读数表明群体成员之间的细胞活性分布均匀，但情况并非如此。单细胞水平的研究揭示了克隆群体内存在显著的细胞间差异，发生在从基因组到表型组的所有层级。这种异质性源于随机事件，如分子位置和数量的变化，或可由主动产生多样性引起。这些过程导致细胞持续循环通过多种生理状态。
调控层级顶部的低丰度分子浓度的变化支配全局基因表达和蛋白质合成以及代谢物形成。它们发挥着特别重要的作用，因为小的偏差会导致高的相对变化。个体细胞在多种表型之间的转变被认为在统计学上增加了群体应对波动环境的能力，因此代表了重要的竞争优势。这些转变的频率和程度被证明与环境变化的频率和程度相关。因此，恒定且完全确定的细胞外环境，减少生理振荡，是对任何细胞生化网络在其原生平衡状态下进行机制描述的关键要求。此外，环境控制对于准确分析环境变化对细胞生理学的影响是必需的。关于此类反应的详细知识将允许改进任何生物过程的效率和性能。
从生理学与环境的强相互关系来看，传统的批量培养技术不允许分析特定且稳定的表型，因为在这些技术中，细胞即时环境的变化众多且无处不在。无论是在搅拌系统还是静态环境中，细胞都受到机械力、离子平衡、营养供应、有毒或抑制性代谢物浓度、群体感应和氧气可用性等方面的持续变化的影响。即使在强烈搅拌的小规模发酵罐中，细胞也会在停滞区中度过相当长的时间，这些区域缺乏底物和氧气，导致生长和大分子合成速率受损。
因此，可以得出结论，全面理解细胞现象的分析方法必须应对全面环境控制和单细胞时间分辨分析的挑战。只有这种方法才能揭示细胞外扰动如何影响细胞的功能状态，从而影响微生物群体的功能结构。Envirostat 2.0通过集成的微流控芯片实验室系统迎接这一挑战，允许在微流中隔离、无接触培养和单细胞时间分辨分析。细胞的无接触隔离和保留通过负介电泳（nDEP）实现，电极呈对称八极排列，电极尖端距离为20 μm。
通过连续培养基流进行细胞灌注，确保营养和氧气的最佳供应以及代谢物的即时去除。由于该系统中的质量传递不仅依赖于被动扩散，还依赖于强制对流，目标细胞的细胞外环境始终具有稳定、环境静态的组成。先前的研究通过计算流体动力学证实了这一点。研究表明，即使对于转化速率高的细胞外物质如葡萄糖和乙醇，在本研究应用的流速下，细胞表面直接邻近区域的培养基组成仅发生最小变化。通过移动液体进行环境控制使Envirostat 2.0系统区别于大多数其他用于单细胞分析的微流控设备，后者主要以分批模式运行。Envirostat外围设备还可以精确控制芯片培养部分的温度。
使用这种单细胞分析系统，系统研究了稳定环境对单细胞生长的影响，并与相应群体特性进行了比较。然而，单个细胞的个体性难以量化，因为受样品处理和检测灵敏度的限制。因此，我们以生长速率代替整体生理，因为它可以通过光学手段在群体和单细胞水平上明确确定。由于其动态性质和与整体生化网络的强连接，生长被广泛用作全局细胞生理学的代理，提供关于细胞健康和功能的信息。
图1 在Envirostat 2.0系统中培养毕赤酵母MutS(A)、多形汉逊酵母RB11 Conphys(B)及谷氨酸棒杆菌 ATCC 13032(C)。细胞通过nDEP技术被捕获于八极笼中心，其体积生长情况通过视频监控进行监测。
本研究提供了一组数据集，其中包含使用Envirostat 2.0单细胞分析系统（图1）在精确设定的（微）环境条件下培养的单个细胞及微群体的具体生长速率。研究涵盖了三种具有微生物学及工业应用价值的菌株：毕赤酵母MutS、多形汉逊酵母RB11 Conphys以及谷氨酸棒杆菌 ATCC 13032。单细胞水平的生长实验在30°C条件下进行：酵母菌株采用标准酵母蛋白胨葡萄糖（YPD）培养基，灌注流速为7.2 nl·min⁻¹；谷氨酸棒杆菌 ATCC 13032则使用脑心浸液（BHI）培养基，灌注流速为9.0 nl·min⁻¹。细胞在使用Envirostat 2.0芯片进行分析前均通过振荡沉降培养法培养，并取自指数生长期早期样本。细胞生长情况通过延时显微镜技术进行监测（图1）。关于实验材料、实验设置与操作流程、数据采集以及八极电极笼的操作细节详见补充材料。
所有三种被调查微生物菌株的体积生长从单细胞阶段到多达8个细胞的微小群体均严格呈指数增长。
值得注意的是，当比较各自的培养实验时，单细胞和微小群体表现出一致且稳健的体积增加。确定的比生长速率高度相似，毕赤酵母MutS为0.34 h⁻¹至0.36 h⁻¹，多形汉逊酵母RB11Conphys为0.45 h⁻¹至0.49 h⁻¹，谷氨酸棒杆菌ATCC 13032为0.55 h⁻¹至0.61 h⁻¹。这些异常高且稳定的生长速率很可能归因于受控的细胞外环境，因此与先前其他研究小组关于单细胞生长的发现不同。
图2. Envirostat 2.0系统中毕赤酵母MutS（A）、多形汉逊酵母RB11Conphys（B）和谷氨酸棒杆菌ATCC 13032（C）的体积生长分析。单个细胞被捕获并培养多代，直至形成多达8个细胞的微小群体。捕获细胞的总细胞体积，归一化为实验系列中观察到的最小细胞，以常用对数标度显示在y轴上。虚线表示体积数据的指数拟合。
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