摘要
基于我们改进的新型沙门氏菌疫苗递送平台，我们优化了减毒重组鼠伤寒沙门氏菌疫苗（RASV）χ12094以递送多种鼠疫耶尔森菌抗原。这些抗原包括LcrV196（氨基酸131-326）、在pYA5383上编码的Psn以及染色体上编码的F1，它们的合成未对细菌生长产生不良影响。口服免疫χ12094(pYA5383)可同时刺激小鼠产生针对LcrV、Psn和F1的高滴度抗体，并对皮下（s.c.）和鼻内（i.n.）高致死剂量鼠疫耶尔森菌CO92攻击提供完全保护。此外，在60天观察期内，口服免疫χ12094(pYA5383)的SCID小鼠未出现死亡或其他疾病症状。因此，这种基于鼠伤寒沙门氏菌的三价活疫苗显示出作为下一代鼠疫疫苗的潜力。
1. 引言
鼠疫是一种臭名昭著的疾病，在三次大流行中夺去了超过2亿人的生命。尽管生活水平和医疗服务有所改善，鼠疫仍在相当数量的国家中呈地方性流行。鼠疫耶尔森菌——一种革兰氏阴性、无运动性、不产孢、两极染色的球杆菌——是鼠疫的病原体。鼠疫在自然界中是动物地方性的，主要通过感染的啮齿动物及其跳蚤传播，这些跳蚤可偶然感染人类。这种通过跳蚤叮咬的间接传播途径导致腺鼠疫，如果不治疗可导致高死亡率。肺鼠疫是由于初始腺鼠疫感染扩散到肺部或吸入含有感染性鼠疫耶尔森菌的飞沫所致，可通过气溶胶在人与人之间传播。未经治疗的肺鼠疫死亡率高达90%至100%。
除自然感染外，鼠疫耶尔森菌过去曾被用作生物武器，该细菌被认为是五大生物武器之一。由于肺鼠疫潜伏期短且能迅速进展为致命感染，受害者可成为二次感染的来源，这在历史鼠疫流行中已有记载。尽管抗生素治疗对暴露后疾病预防有效，但已从马达加斯加的鼠疫患者中分离出对八种抗生素耐药的鼠疫耶尔森菌株。此外，最近一项研究从蒙古获得的分离株进一步证实了天然存在的多重耐药鼠疫耶尔森菌变异株的存在。因此，迫切需要有效的暴露前和暴露后预防手段。
在过去10年中，我们的团队致力于开发一系列大幅改进的方法，以增强沙门氏菌抗原递送疫苗的安全性、有效性和实用性。我们发现，单独合成LcrV196或Psn的减毒重组沙门氏菌疫苗（RASV）株可保护小鼠免受鼠疫耶尔森菌CO92的皮下（s.c.）或鼻内（i.n.）攻击。此外，用递送YadC的RASV免疫可诱导小鼠对腺鼠疫的部分保护，但不能保护肺鼠疫。然而，YadC合成对细菌有毒性，可严重阻碍细菌生长。此外，当RASV株递送YadC和LcrV196组合时，未能显示显著保护效果。尽管F1抗原（由caf1编码）是否是必要的毒力抗原存在疑问，因为F1阴性鼠疫耶尔森菌株在动物感染模型中可引起显著疾病，但用F1免疫小鼠可产生凝集鼠疫杆菌的血清，并保护小鼠和大鼠免受鼠疫耶尔森菌的皮下攻击。抗F1抗体还可通过被动转移F1免疫兔血清保护猕猴免受肺鼠疫。因此，将F1纳入多抗原组合应增强对表达F1的鼠疫耶尔森菌株的保护性免疫。
在本研究中，我们使用RASV株递送多种鼠疫抗原（LcrV196、Psn和F1），并评估其保护小鼠免受毒力鼠疫株攻击的能力。
2. 材料与方法
2.1. 细菌菌株和培养基
本研究中使用的细菌菌株和质粒列于表1。大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌UK-1株常规在37°C的LB肉汤或LB琼脂上培养。鼠伤寒沙门氏菌UK-1突变株在需要时补充50μg/ml二氨基庚二酸（DAP）、0.05%阿拉伯糖或0.1%甘露糖以促进细菌生长。测定脂多糖（LPS）谱时使用无碳水化合物营养肉汤（NB）。基于sacB的反向筛选使用含5.0%蔗糖的LB琼脂。含1%乳糖的MacConkey平板用于指示糖发酵。动物实验中，鼠伤寒沙门氏菌株在含适当补充物的LB肉汤中培养。过夜培养物稀释1:100，在有氧条件（200rpm）下培养至600nm光密度约0.85。然后在室温下以5000g离心15分钟，并重悬于含0.01%明胶的缓冲盐水（BSG）中。LB琼脂平板用于计数从小鼠组织中回收的鼠伤寒沙门氏菌。鼠疫耶尔森菌CO92株常规在含0.2%木糖的心浸液肉汤（HIB）中28°C培养用于皮下攻击，37°C培养用于鼻内攻击研究。除非另有说明，所有培养基均购自BD Difco。
2.2. 质粒构建
基因片段Plpp-lacO-2-psn（Plpp-lacO-2在Plpp-lacO和psn起始密码子之间含有6个额外碱基）和Ptrc-bla ss-lcrV196-bla CT（同向转录）被克隆到质粒pYA3620中形成pYA5383（图1A）。所有DNA插入片段的序列通过DNA序列分析确认。所有引物列于补充材料和方法的表S1中。
2.3. 细菌突变株构建
鼠伤寒沙门氏菌突变株使用自杀载体通过接合构建。亲本鼠伤寒沙门氏菌株在含DAP（50μg/ml）的LB琼脂平板上与携带相关自杀载体的大肠宿主株χ7213进行交配。转接合子在含自杀载体赋予抗性的抗生素但不含DAP的LB琼脂上通过生长筛选。具有ΔasdA突变的接合子在含抗生素的亚硒酸盐胱氨酸琼脂平板上划线，补充DAP以抑制大肠杆菌生长。通过PCR和表型验证确认有和无插入的确定缺失突变。表1列出了构建的菌株χ12042和χ12094。
表1 本研究中使用的菌株和质粒
| 菌株或质粒 | 基因型或相关特性 | 来源或衍生 |
|---|---|---|
| 菌株 | ||
| 大肠杆菌TOP10 | F⁻ mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 araD139 Δ(ara-leu)-7697 galU galK rpsL (Strʳ) endA1 nupG | Invitrogen |
| χ6212 | F⁻ Δ⁻ φ80 Δ(lacZYA-argF) endA1 recA1 hsdR17 deoR thi-1 glnV44 gyrA96 relA1 ΔasdA4 | |
| 鼠伤寒沙门氏菌UK-1 χ12042 | Δpmi-2426 Δ(wza-wcaM)-8 ΔasdA33 ΔrelA197::araC PBAD lacI TT ΔPfur33::TT araC PBAD fur ΔPcrp527::TT araC PBAD crp | 本研究 |
| χ12094 | Δpmi-2426 Δ(wza-wcaM)-8::Plpp-lacO-caf1M-caf1A-caf1 ΔasdA33 ΔrelA197::araC PBAD lacI TT ΔPfur33::TT araC PBAD fur ΔPcrp527::TT araC PBAD crp | |
| 鼠疫耶尔森菌CO92 | Pgm⁺, pMT1, pPCP1, pCD1Ap | |
| 质粒 | ||
| pBAD/hisB | 表达载体 | 实验室收藏 |
| pYA3342 | Asd⁺ pBR ori | |
| pYA3841 | Asd⁺ pBR ori, bla-SS-lcrV196-CT基因片段在Ptrc启动子下 | |
| pYA4836 | 鼠疫耶尔森菌KIM6⁺ (pCD1Ap)的lcrV基因与C端6×His融合，克隆到pBAD/HisB的NcoI和HindIII位点 | 本研究 |
| pYA5049 | 鼠疫耶尔森菌KIM6⁺ (pCD1Ap)的psn基因克隆到pBAD/HisB的NcoI和HindIII位点 | 本研究 |
| pYA5333 | pYA3342的Ptrc启动子被Plpp-lacO-2替换（Plpp-lacO-2在Plpp-lacO的C端含有6个额外碱基） | |
| pYA5338 | caf1M-caf1A-caf1-6xHis在pYA3342的Ptrc启动子控制下 | 本研究 |
| pYA5381 | 天然psn克隆到pYA5333的NcoI和HindIII位点 | 本研究 |
| pYA5383 | 从pYA3841扩增的Ptrc-bla-SS-lcrV196-CT克隆到pYA5381的SacI和XmaI位点 |