分子鉴定
通过氯仿/异戊醇方法5从分离株的酵母相中提取基因组DNA(DNA)，用于部分β-微管蛋白(β-tub)和几丁质合酶(CHS)编码基因的测序1，以及如所述进行T3B聚合酶链反应(PCR)指纹分析43。在T3B PCR指纹分析中，对照菌株为巴西孢子丝菌(CBS120339)、墨西哥孢子丝菌(MUM11.02)、申克孢子丝菌(ATCC32286)和球形孢子丝菌(IPEC27135)。在测序分析中，巴西孢子丝菌(CBS120339)、球形孢子丝菌(FMR8600)、墨西哥孢子丝菌(CBS120341)、苍白孢子丝菌(CBS111110)和申克孢子丝菌(FMR8604)用作来自国家生物技术信息中心(NCBI)公共Genbank的参考菌株。
巨噬细胞实验
进行了使用J774巨噬细胞的体外毒力实验，以确定巨噬细胞吞噬和杀死巴西孢子丝菌酵母的能力，以及这种相互作用后巨噬细胞的活力。44 J774系的巨噬细胞在培养板中以单层生长，在含有10%胎牛血清、10%NCTC-109、1%非必需氨基酸和1%青霉素/链霉素的培养基中，该培养基用杜尔贝科改良Eagle培养基(DMEM)稀释，在37°C，10%CO2条件下，并分到96孔板中。将5株巴西孢子丝菌分离株的酵母细胞，先前通过豚鼠血清补体(MP Biomedicals)孵育30分钟进行调理，以5:1的比例添加到巨噬细胞单层中。
体内实验
为了评估体内毒力，使用25μL Hamilton®注射器给大蜡螟（Vanderhorst Wholesale,Inc.）幼虫接种104、106或107个酵母细胞（五种巴西孢子丝菌分离株之一，稀释在10μL PBS中），并分析幼虫存活率。40作为对照，一组幼虫接种了巴西孢子丝菌参考菌株(CBS120339)。阴性对照组包括未接种的幼虫（“Control”）和注射10μL无菌PBS的幼虫（“PBS”）。这些实验在不同日期进行了三次重复。每组由20只幼虫组成，在90 mm培养皿中于37°C下维持，并每天评估大蜡螟。在0天（接种日）和2天（接种后48小时）对组进行拍照（Canon EOS DIGITAL REBEL）。死亡幼虫（通过缺乏主动或触摸诱导的运动且通常颜色变黑来识别）从组中移除并丢弃。获得生存曲线以比较分离株对幼虫的影响。
在相同条件下，每组10只幼虫的平行组用于CFU测定。在接种后3天或6天，处死每组3只幼虫。将内部内容物研磨并在2 mL PBS中匀浆，然后通过40μm细胞过滤器过滤。取100μL这种匀浆液铺在含有0.4 g/L放线菌酮和1%青霉素/链霉素的BHI琼脂上以防止污染，并在37°C下孵育。五天后，测定CFU。
体外推定毒力因子的产生
a.脲酶
为了验证脲酶产量，将每种分离株相当于2.0 McFarland比浊度的酵母细胞悬浮液0.5 mL接种到4.5 mL Christensen尿素肉汤中，45,46并在37°C下孵育。四天和七天后，将试管以1,575 g离心（Centrifuge 5804R,Eppendorf），并将100 uL上清液一式三份转移到96孔聚苯乙烯平底板（Corning,Tewksbury,USA）中。新型隐球菌(ATCC32045)和近平滑念珠菌(ATCC22019)分别用作阳性和阴性对照。使用Biotek分光光度计（Epoch型号）在559 nm波长下获得样品吸光度(O.D.)。
b.蛋白酶
蛋白酶活性按描述测量，使用以下混合物：2%琼脂，15 mM葡萄糖，13 mM甘氨酸，29.4 mM KH2PO4，10 mM MgSO4，3 mM硫胺素，0.1%azoalbumin(pH 4.5)。对于蛋白质琼脂清除，每种分离株的酵母细胞通过穿刺接种在该混合物上，并在37°C下孵育21天。孵育后，检查菌落周围是否产生azoalbumin降解晕圈。当观察到蛋白水解活性时，用毫米尺测量菌落直径(p)和azoalbumin降解晕圈直径(z)，并计算p/z值作为两个直径的比率。
c.黑色素
根据Almeida-Paes等人描述的方法获得黑色素“幽灵”。48然后通过简单的DHN-黑色素/酵母干重比(w/w)计算每种分离株的二羟基萘(DHN)-黑色素比例。
耐热性
每种5株分离株的酵母在37°C的BHI肉汤中生长，3天后，将2 mL酵母溶液离心，重悬于PBS中，并进行10倍稀释以获得3种不同的稀释度。将2.5μL滴液接种在BHI琼脂平板上，并在35、37或39°C的37900型培养箱中孵育。三天和六天后，定性验证平板以确定是否存在菌落生长。
生长曲线
5株分离株的巴西孢子丝菌酵母细胞在BHI肉汤(Difco)中于37°C生长3天。根据Medina等人描述的方法稍作修改，使用Bioscreen C微生物生长曲线分析系统（Labsystems,Helsinki,Finland）连续评估浊度作为生长的量度。使用制造商提供的Easy Bioscreen Experiment(EZExperiment)软件记录数据。
对氧化剂的敏感性
每种分离株的真菌细胞（1 x 10<sup>7</sup>个酵母）在37°C的BHI琼脂斜面上生长5天后收获，用PBS洗涤3次，并提交给化学生成的一氧化氮、活性氮中间体和氧源性氧化剂，如先前所述。<sup>15</sup>在37°C下与氧化剂孵育1、2、3和4小时后，将酵母铺在平板计数琼脂（Bio-Rad）上，通过CFU计数确定存活率。未经处理的细胞等分试样也作为对照铺板。某个时间点每种分离株的存活率是该时间点的CFU计数/对照CFU计数的比率，以百分比表示。
抗真菌药敏试验
根据临床和实验室标准协会(CLSI)方案，使用分生孢子进行药敏试验。使用CLSI描述的用于丝状真菌（包括申克孢子丝菌）的微量稀释法M38-A2（0.016-8μg/mL）<sup>50</sup>研究了5株分离株对两性霉素B、酮康唑、伊曲康唑、伏立康唑和特比萘芬的敏感性。将细胞在RPMI 1640中稀释，最终浓度为2 x 10<sup>4</sup>至1 x 10<sup>5</sup>个细胞/mL。对于两性霉素B、伊曲康唑和伏立康唑，最低抑菌浓度(MIC)终点是产生完全生长抑制的最低浓度。对于酮康唑，MIC是导致生长减少50%的最低浓度，对于特比萘芬，它是导致生长减少至少80%的最低浓度。
统计检验
在分析中使用了非参数检验（例如，Kruskal-Wallis检验比较生长曲线和CFU，Kaplan-Meier估计量用于大蜡螟的存活率，Log-rank(Mantel-Cox)检验用于比较生存曲线）来比较5株分离株，P值<0.05被认为是显著的。使用GraphPad Prism 6 for Windows,GraphPad Software,Inc.进行图表构建和统计。使用Microsoft Excel 2010/2013(Microsoft Corporation,Redmond,Washington,USA)进行百分比计算和分析。
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