PknB是一种必需的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，对分枝杆菌细胞分裂和细胞壁生物合成至关重要。在此，我们证明在分枝杆菌中过表达外部PknB_PASTA结构域会导致再生长延迟、细长细菌积累以及对β-内酰胺抗生素敏感性增加。这些变化伴随着蛋白质组学研究所揭示的某些参与细胞壁生物合成的酶的产生改变。由PknB_PASTA结构域过表达引起的生长抑制被镁离子浓度升高完全消除，但不会被肽聚糖片段消除。最后，我们证明添加重组PASTA结构域可以阻止结核分枝杆菌的再生长，因此为控制这种病原体的复制提供了另一种机会。这些结果表明，PknB_PASTA结构域参与调控肽聚糖生物合成和维持细胞壁完整性。
1. 引言
丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（STPKs）广泛分布于革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌中。结核分枝杆菌是结核病的致病病原体，拥有11种STPKs，其中PknA和PknB对实验室培养中的生长是不可或缺的，而PknE、PknG和PknH与结核分枝杆菌的毒力有关。必需激酶PknB属于仅在革兰氏阳性细菌中发现的一类独特的STPKs家族。这些激酶的重要特征是表面暴露区域存在所谓的PASTA（青霉素结合蛋白和丝氨酸/苏氨酸激酶相关）结构域。
在厚壁菌门中，含有PASTA结构域的激酶对生长并非必需。在金黄色葡萄球菌中，Stk1突变株毒力受损，对Triton X-100和磷霉素具有更高的抗性；而在肺炎链球菌中，StkP激酶对感受态、生物膜形成和毒力很重要。对肺炎链球菌中StkP作用的更详细研究证实，它在生长过程中协调细胞分裂和肽聚糖合成方面发挥着关键作用。相比之下，枯草芽孢杆菌中的PrkC被证明对静止期存活很重要。prkC缺失突变株在静止期的光密度显著低于野生型杆菌。然而，在后续研究中证实，PrkC调控了一种新的肽聚糖介导的萌发途径，并可能通过控制YocH muralytic酶的表达来重塑细胞壁。在天蓝色链霉菌中，含有PASTA结构域的激酶PknB调控碳通量和抗生素产生，对生长并非必需。在谷氨酸棒杆菌中，PknB对生长也是可有可无的，只有在缺失多个STPKs的突变株中才能检测到复制和细胞形状的显著变化。在该细菌中，PknB显然调控FtsZ的聚合；然而，这一观察结果的精确机制和生物学意义需要进一步研究。
分枝杆菌似乎是PknB对生长至关重要的独特细菌类群。其在耻垢分枝杆菌和牛分枝杆菌BCG中的过表达或部分耗竭导致细胞形态和生长的显著改变；PknB的酶活性被证明对这些观察到的效应至关重要。在过去十年中，PknB底物的鉴定取得了重大进展。它们包括来自不同功能类别的蛋白质：细胞壁酶——InhA、PbpA和MabA；调控蛋白——SigH、GarA和FhaA；以及参与细胞分裂的蛋白质——Wag31和MviN。此外，PknB调控"氧介导的复制开关"，因此调控休眠和复苏的转换。因此，PknB被认为是开发抗结核抗菌药物的关键药物靶点。已研究了PknB激酶抑制剂用于杀灭结核分枝杆菌的可能应用。然而，仅取得了有限的成功，主要是因为这些药物渗透到分枝杆菌细胞中的能力较差。
PknB由几个结构域组成（图1）；其中一些的功能已经确定，而其他结构域的精确作用仍不清楚。PknB的组分包括一个保守的催化激酶结构域、一个连接跨膜区的近膜部分，以及由PASTA组成的表面暴露感受元件，被指定为PknB_PASTA结构域。PASTA结构域被认为可以识别新生肽聚糖的延伸链并激活STPKs。结构研究表明，枯草芽孢杆菌PASTA结构域以相对较高的亲和力结合合成肽聚糖片段，肽聚糖中二氨基庚二酸的存在对这种结合至关重要。来自分枝杆菌的PknB_PASTA结构域也可以结合合成肽聚糖片段；然而，这种结合是否影响PknB的激活、细菌生长和复苏仍不清楚。
在本研究中，我们研究了细胞外PknB_PASTA结构域本身是否在分枝杆菌生长中发挥独特作用，因此是否可以作为药物靶点或新型化疗药物。这里呈现的结果表明，PASTA结构域可能识别延伸的肽聚糖链，并调控青霉素结合蛋白的产生以及参与分裂和隔膜生成的蛋白质的分布。此外，我们的数据表明，PknB_PASTA结构域与细胞壁的相互作用很重要，其丰度可能作为控制细胞壁完整性和细菌生长的机制。
2. 材料与方法
2.1 细菌菌株和培养基
耻垢分枝杆菌mc2155、牛分枝杆菌BCG Glaxo菌株和结核分枝杆菌H37Rv在Sauton培养基或Middlebrook 7H9培养基（添加白蛋白-葡萄糖复合物，指定为补充7H9培养基）中培养。耻垢分枝杆菌也在溶菌肉汤（LB）中培养，添加0.05%（w/v）Tween 80以防止细菌聚集。所有细菌菌株在37°C下于BD Falcon锥形管或锥形瓶中振荡培养。需要时，按以下浓度（μg mL⁻¹）添加抗生素：潮霉素50；卡那霉素50；四环素0.02。
细菌生长通过Jenway分光光度计在580 nm处测量吸光度来跟踪。如前所述，使用Bioscreen全自动生长曲线分析仪进行耻垢分枝杆菌在各种培养基中的生长实验。呈现的Bioscreen数据是两个独立实验的五次重复的平均值。所有生长实验使用三个独立转化子。通过7H10琼脂上的菌落形成单位（CFU）估计来测定存活率。从对数生长期（OD₅₈₀≈0.6-0.8）的结核分枝杆菌培养物中制备上清液，过滤灭菌两次并立即用于实验。对于剂量依赖性实验，培养上清液被冷冻干燥并用无菌水复溶。对于低镁对照实验，Sauton培养基中MgSO₄的浓度为0.2 mM。
2.2 显微镜观察
将耻垢分枝杆菌杆菌装片于PBS中，使用配备100 W汞灯光源的Diphot 300倒置显微镜通过相差显微镜观察。使用12/10位高速Peltier冷却CCD相机（FDI，Photonic Science）和IMAGE-PRO PLUS（Media Cybernetics）软件记录图像。如前所述进行新生肽聚糖的标记。简要步骤如下：将分枝杆菌在含20 ng mL⁻¹四环素的Sauton培养基中培养至指数生长期（OD₆₀₀≈0.5）。将万古霉素-BODIPY（Life Technologies）和未标记万古霉素（1:1）的混合物加入培养物至终浓度2 mg mL⁻¹，然后在37°C下振荡孵育2小时。用含0.1% Tween 80的PBS洗涤细菌两次，用于荧光显微镜观察。
2.3 PknB过表达研究构建体的构建
从结核分枝杆菌H37Rv DNA中扩增pknB基因及其变体，并克隆到pMind质粒的BamHI和SpeI位点中。构建体通过测序确认，并通过电穿孔转化到耻垢分枝杆菌或结核分枝杆菌中。通过添加四环素诱导pknB或其变体的过表达，并通过qRT-PCR确认。
2.4 肽聚糖片段的制备
按照先前描述的方法分离和纯化大肠杆菌和分枝杆菌的肽聚糖。对于生长实验，用变溶菌素、溶菌酶、RpfB或MltA在37°C下消化肽聚糖（2 mg）长达72小时。Muramidase的最终浓度为100 μg mL⁻¹。用变溶菌素和MltA消化肽聚糖在含80 mM NaH₂PO₄（pH 4.8）的缓冲液中进行；用溶菌酶在25 mM NaH₂PO₄（pH 6.0）中进行；用RpfB在40 mM柠檬酸钠（pH 6.5）中进行。通过HPLC确认肽聚糖片段的存在。在单独的实验中，将肽聚糖超声处理三次，每次30秒，短暂以100 g离心去除大片段，用于生长实验。合成肽聚糖片段按照先前描述的方法制备。
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