1.3.2制备液化沙雷氏菌菌悬液
液化沙雷氏菌SCB2649菌株经LB固体培养基活化2代后,用无菌接种环挑取单菌落一环于5 mL TSB液体培养基中,28℃培养20 h,6 000 r/min离心5 min,弃上清液,用无菌胰蛋白胨大豆肉汤稀释至1～2×107CFU/mL,备用。
1.3.3最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)的测定
采用倍比稀释法测定植物乳杆菌SCB2505代谢物对液化沙雷氏菌的最小抑菌浓度[15]。取菌悬液100μL至96孔细胞培养板中,再取溶于无菌去离子水的代谢物100μL加到上述孔中,使代谢物终质量浓度分别为32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 mg/mL。对照组加入100μL去离子水和100μL菌悬液。将96孔细胞培养板放置于28℃生化培养箱培养24 h,培养后用肉眼观察孔中菌液的浊度,选定菌液澄清透明的最低植物乳杆菌SCB2505代谢物浓度为MIC。
1.3.4 SCB2505对液化沙雷氏菌生长曲线的影响
参照石超[16]的方法并稍作修改。取1.3.2节所得菌悬液100μL至96孔细胞培养板中,再取浓度分别为1.0 MIC、2.0 MIC代谢物溶液100μL加到上述孔中,使代谢物终质量浓度分别为0.5 MIC、1.0 MIC,以无菌去离子水替代代谢物作为对照,每个浓度3孔。将96孔细胞培养板于28℃培养24 h,每间隔1 h测定1次OD600nm值,并以时间为横坐标,光密度值为纵坐标绘制生长曲线。
1.3.5植物乳杆菌代谢物的抑菌成分分析
1.3.5.1 SCB2505代谢物溶液的制备
用无菌去离子水溶解代谢物,使代谢物的质量浓度为43 mg/mL,放置于4℃中待用。
1.3.5.2温度敏感性测定
将LB培养基融化后待其冷却至48～50℃,加入指示菌液化沙雷氏菌菌液,使培养基含菌量为5×105 CFU/mL,混匀后倒入平板,晾干后用打孔器(d=7.8 mm)在平板上打孔并挑去琼脂块。将1.3.5.1节制备的代谢物溶液分别在70、100、121℃加热处理20 min,以未处理的代谢物溶液为对照,每孔滴加样液90μL,于28℃培养10 h,测量抑菌圈直径。
1.3.5.3 pH敏感性测定
采用1.3.5.2节的方法制备指示菌平板。用1 mol/L稀盐酸、氢氧化钠溶液调整代谢物溶液pH值分别为3.0、5.0、7.0、9.0,将乳酸(与未处理的代谢物溶液pH值一致)和未处理的代谢物溶液(pH 3.54)为对照,每孔滴加样液90μL,于28℃培养10 h,测量抑菌圈直径。
1.3.5.4乳酸验证试验
采用1.3.5.2节的方法制备指示菌平板。参考乳酸测试盒步骤进行操作,测定20 mL植物乳杆菌SCB2505代谢物溶液中的乳酸含量。取试管,在A管中注入6 mL代谢物溶液,在B、E管中注入6 mL无菌MRS液体培养基,C、D管注入6 mL无菌水,然后用25%乳酸调节B管(同时记录乳酸添加量)、C管至与A管相同pH,在D管中注入与B管等量的乳酸,实验以E管为空白对照,每孔滴加样液90μL,28℃培养10 h,测量抑菌圈直径。
1.3.5.5酶敏感性测定
采用1.3.5.2节的方法制备指示菌平板。将胰蛋白酶、胃蛋白酶、过氧化氢酶分别加入到装有5 mL代谢物溶液的试管中,使各酶终质量浓度为1 mg/mL,用1 mol/L稀盐酸、氢氧化钠溶液分别将pH调整为8.0(胰蛋白酶)、1.8(胃蛋白酶)、过氧化氢酶(7.0),37℃水浴2 h,再用稀盐酸和氢氧化钠溶液调至初始pH,以未进行蛋白酶处理的代谢物溶液为对照,每孔滴加样液90μL,28℃培养10 h,测量抑菌圈直径。
1.3.6 SCB2505代谢物对液化沙雷氏菌生物被膜的影响
参考王琳等[17]的方法稍作修改。取1.3.2节所得菌悬液100μL至96孔细胞培养板中,再取浓度分别为1.0 MIC、2.0 MIC和4.0 MIC代谢物溶液100μL加到上述孔中,使代谢物终质量浓度分别为0.5 MIC、1.0 MIC、2.0 MIC,以无菌去离子水替代代谢物作为对照,每个浓度3孔。将96孔细胞培养板于28℃培养24 h。然后弃去菌液,用PBS清洗3次,加入200μL甲醇固定15 min,后弃去甲醇,加入200μL 0.1%结晶紫染液染色20 min,弃去染色液,用PBS清洗3次,干燥后,加入200μL 95%乙醇溶液溶解残留的染色液,用酶标仪测定OD590nm值,计算生物被膜抑制率。生物被膜抑制率的计算如公式(1)所示:
