微生物分析
在每次处理后立即确定接种的未处理（对照）和处理样品中枯草芽孢杆菌孢子的计数。液体样品在1%缓冲蛋白胨水（Pronadisa，西班牙）中连续稀释，将0.1 mL适当稀释液表面涂布到胰蛋白胨大豆琼脂（TSA，Pronadisa，西班牙）上。在30°C孵育培养皿72小时后，计数枯草芽孢杆菌菌落，结果以每毫升Log CFU表示。培养皿在30°C再放置七天，以验证没有更多CFU出现。微生物灭活计算为Log（N₀/N），其中N₀代表初始细胞计数（未处理样品），N代表处理后细菌计数（处理样品）。使用方差分析和Tukey诚实显著差异检验确定处理之间的显著差异（p<0.05）（SPSS Inc.，美国）。
孢子发芽和营养生长测定
通过测量600 nm处的光密度（OD₆₀₀）并自动使用Bioscreen C分析仪系统监测孢子发芽及随后营养生长的过程。每个微孔板孔含有300 μL TSB，接种30 μL孢子悬浮液，初始OD₆₀₀为1.0。微孔板在30°C孵育长达48小时，每5分钟监测每个微孔板孔的OD₆₀₀。每次测量前微孔板摇动10秒以防止孢子沉降。每次测定中每种条件和阴性对照进行三个重复孔。实验至少重复三次。发芽程度表示为初始OD₆₀₀的分数（时间t时的OD₆₀₀/初始OD₆₀₀）。通过相差显微镜直接观察验证枯草芽孢杆菌细胞的发芽。
发芽期间孢子热抗性的测定
为检查PL对枯草芽孢杆菌孢子热抗性的影响，在发芽和随后生长的不同时间间隔从微孔板孔中取出样品。然后，枯草芽孢杆菌细胞接受热处理（90°C，10分钟），该处理破坏营养细胞但仅引起轻微的孢子灭活（<1 Log）。热处理在带有硅胶隔膜的螺旋盖玻璃管（Sigma，Aldrich，西班牙）中进行。将含有2.7 mL蒸馏水的试管浸入油恒温浴（PolyStat37，Fisher Scientific，英国）中并预热至90°C。将K型热电偶（T1光纤温度探头，加拿大）插入未接种的试管中用于控制温度。试管平衡至适当温度后，使用1 mL注射器（Hamilton，瑞士）将300 μL孢子悬浮液注入每个试管。加热试管在预定暴露时间间隔（10分钟）后从恒温浴中取出，并立即放入冰浴中。试管保持在冰中直至存活者计数。
发芽及随后营养生长期间孢子对PL抗性的测定
为确定PL处理对发芽及随后生长期间枯草芽孢杆菌细胞灭活的影响，在适当时间间隔从微孔板孔中取出样品。PL处理前，细胞通过在4°C下以10,000×g离心10分钟洗涤两次，并重悬于蒸馏水中。样品接受0.5、1.6、2.2或3.3 J/cm²的总能量密度处理。
结果与讨论
PL处理对枯草芽孢杆菌细胞发芽和营养生长的影响
PL处理对枯草芽孢杆菌孢子灭活的影响如表1所示。枯草芽孢杆菌孢子计数的减少随总能量密度的增加而增加。在高密度孢子悬浮液（10⁹孢子/mL）中，经过12 J/cm²总能量密度处理后观察到超过7 Log的减少，这证明了PL技术在微生物灭活方面的潜力。然而，相当数量的枯草芽孢杆菌孢子在较低强度的PL处理后存活。这些活孢子可能在有利条件恢复时发芽并成为营养细胞，导致食品腐败甚至食源性疾病。因此，PL处理对孢子发芽的影响是其在食品工业应用中需要考虑的关键因素。
表1 PL处理后枯草芽孢杆菌孢子的减少量
| 总辐照剂量（J/cm²） | 枯草芽孢杆菌孢子减少量（对数 CFU /mL） |
|---|---|
| 0.3 | 0.23±0.01a |
| 1 | 2.26±0.21b |
| 2 | 3.80±0.05c |
| 5.5 | 5.98±0.09d |
| 12 | 7.9±0.03e |
孢子悬浮液在600 nm处的光密度（OD₆₀₀）测量使用Bioscreen C生长曲线分析仪监测发芽及随后生长的过程。图1显示了不同PL处理强度对枯草芽孢杆菌孢子发芽的影响。OD₆₀₀结果表明，任何PL处理都可能影响孢子发芽及随后的生长。低强度处理似乎不影响孢子发芽，因为在0.3、1或2 J/cm²总能量密度下处理的孢子的OD₆₀₀下降与未处理孢子没有明显差异。培养物的光密度在2小时前下降至初始值的约50%，这一过程与孢子发芽最早阶段吡啶二羧酸（DPA）的释放和孢子核心的再水化同时发生。
这些结果表明，尽管枯草芽孢杆菌孢子在PL处理后失去了可培养性，但其中许多仍然存活（表1），这可能是由于它们的孢子在平板计数方法使用的特定恢复条件下（例如黑暗孵育）无法恢复活跃生长。另一方面，暴露于更高的总能量密度（5.5和12 J/cm²）显著延迟了OD₆₀₀的下降（通过相差显微镜直接观察验证），该阶段与孢子发芽相关（图1）。
图1 PL处理对枯草芽孢杆菌（B. subtilis）萌发及营养生长的影响。黑色实线表示未处理孢子组，灰色实线表示0.3 J/cm² PL处理组，黑色虚线表示1 J/cm² PL处理组，灰色虚线表示2 J/cm² PL处理组，黑色点线表示5.5 J/cm² PL处理组，灰色点线表示12 J/cm² PL处理组。数据点为至少三次独立实验的平均值。
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