云杉水解物
本研究中使用的云杉水解物由SEKAB E-Technology AB（瑞典恩舍尔兹维克）提供。它由云杉木片通过SO2浸渍蒸汽爆破预处理制备。水解物的组成此前已有报道。
菌株在云杉水解物培养基中抑制剂耐受性的筛选
酵母菌株库的初始抑制剂耐受性筛选在含有递增浓度云杉水解物全浆液（40%至70%）的琼脂平板上进行，补充酵母提取物（10克/升）和细菌学蛋白胨（20克/升）。pH用4M KOH调节至5.5。选定菌株的进一步筛选在半厌氧发酵条件下使用稀释至30%的预处理云杉材料全浆液在YP培养基中进行，并补充葡萄糖至终浓度200克/升，考虑到水解物中已存在的初始葡萄糖浓度。对于最耐受菌株JT21653分离株的筛选，云杉水解物的浓度增加到77%，并补充YP和70克/升葡萄糖。发酵在1.3克/升细胞密度、60毫升体积、30°C、连续搅拌200转/分钟条件下开始。然后通过测量CO2释放引起的重量损失来跟踪表观发酵速率。
分离株在D-木糖培养基中生长和发酵的筛选
分离株在D-木糖培养基中生长能力的预筛选在24孔板中进行，含有1毫升YP培养基，补充20克/升D-木糖。细胞从在酵母提取物蛋白胨葡萄糖培养基中过夜生长的预培养物中接种，初始OD600为1.0。在30°C轨道摇床中培养20小时后测量OD600。
为了选择能够有效发酵D-木糖的菌株，在35°C下半厌氧批次发酵在含有40克/升D-木糖作为碳源的50毫升YP培养基中进行。为此，使用体积为150毫升的圆柱形管，配有带有棉塞玻璃管的橡胶塞。初始接种密度为1.3克干重/升。培养物用磁力棒以120转/分钟连续搅拌。通过跟踪CO2释放引起的重量损失来估计发酵速率。
菌株在D-木糖-葡萄糖混合物中发酵性能的评估
为了评估含有D-木糖和葡萄糖的培养基中的发酵性能，批次发酵在300毫升摇瓶中进行，工作体积为200毫升，35°C。初始接种密度为1.3克干重/升。摇瓶用含有甘油的发酵锁封闭。接种后用氮气吹扫直至氧浓度达到约2 ppm。培养物用磁力搅拌器以120转/分钟连续搅拌。每隔几小时用针头取样进行高效液相色谱HPLC分析。
菌株在云杉培养基中发酵性能的评估
为了评估云杉水解物中的发酵性能，预处理云杉材料在250毫升摇瓶中以11%固体负荷使用（对应于约50%浆液），工作体积为150毫升。添加酵母氮基1.7克/升和硫酸铵（5克/升）作为补充。由于预处理云杉材料未进行酶水解，添加葡萄糖和D-木糖至终浓度分别约为62克/升和18克/升。发酵在初始细胞密度为4克干重/升时开始，在35°C下用磁力棒以200转/分钟连续搅拌孵育。每隔几小时通过连接到摇瓶底部侧面的塑料管取样进行分析，无需引入空气。
超高浓度发酵
超高浓度发酵按此前描述的方法进行，在150毫升体积圆柱形管中含有100毫升YP培养基，补充330克/升葡萄糖，30°C。制备的接种物在约20-30毫升将用于发酵的培养基等分试样中重悬，并以1.3克干重/升的初始细胞密度接种到100毫升最终体积中。用磁力棒以120转/分钟连续搅拌或仅在前4小时搅拌（静态发酵情况下）。从CO2释放引起的重量损失跟踪发酵速率。在结束时取样进行乙醇浓度分析。
流式细胞术测定倍性
DNA含量的流式细胞术分析按此前报道的方法进行。简而言之，指数生长期细胞用冰冷无菌水洗涤并用70%乙醇固定。细胞用RNase（1毫克/毫升）处理，DNA用碘化丙啶（0.046 M）在50 mM Tris、pH 7.7和15 mM MgCl2中于4°C染色约48小时。使用FACScan仪器（Becton Dickinson）测量荧光强度。
减数分裂重组
相反交配型的菌株通过在酵母提取物蛋白胨葡萄糖平板上混合少量各菌株细胞进行杂交。30°C孵育24小时后，再次混合细胞并重新孵育24小时以提高交配效率。随后将混合物涂布在酵母提取物蛋白胨葡萄糖平板上进行单菌落分离。通过聚合酶链反应和流式细胞术分析几个菌落以鉴定二倍体。选定的MATa/α二倍体在1%乙酸钾中孢子形成5至7天，23°C。使用MSM显微操作器（Singer instruments，英国萨默塞特）通过四分体解剖分离孢子。
交配型的测定
交配型通过聚合酶链反应和激素测定确定。聚合酶链反应使用退火到MAT位点的引物和MATa或MATα特异性引物进行。交配型进一步通过激素测定验证。为此，将两种测试菌株酿酒酵母MATa bar1-Δ和MATα sst2-Δ的少量细胞分别接种在50°C的1%琼脂中。混合物立即倒在酵母提取物蛋白胨葡萄糖平板上。顶层琼脂凝固后，将约10微升待测试菌株的细胞悬液点在每种测试平板上，30°C孵育24小时。MATα细胞在bar1-Δ菌株平板上显示生长抑制区，而MATa细胞在sst2-Δ菌株平板上显示生长抑制区。二倍体细胞不产生抑制区。
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