2 结果与分析
2.1 gIgE同源臂片段的鉴定
以FHV-1 H07作为模板,通过PCR获得包含整个gIgE左同源臂、gIgE基因以及gIgE右同源臂片段。PCR结果(图1)中出现1条3 789 bp的目的条带,回收后进行基因序列测定,将测序结果与C-27株的序列进行比对,表明成功获取同源臂片段。
图1 gIgE同源臂片段的PCR结果
2.2 敲除质粒sgRNA的构建与验证
酶切pX458-Neo R质粒获得的线性载体片段的电泳结果(图2-A)显示了1条9 400 bp的目的条带,回收此条带并分别与3 条sgRNA片段室温过夜连接后转化感受态Stbl3大肠杆菌。次日每种sgRNA各挑取单个菌落,培养3～4 h后吸取100 μL菌液进行测序,将与图谱序列一致的菌种(图2-B)质粒进行提取,即是敲除质粒sgRNA。
图2 sgRNA质粒的构建与验证结果
2.3 gIgE基因缺失病毒的免疫荧光鉴定
将合成的转移载体pUC-gIgE-L-RFP-R和3条sgRNA分别转染F81细胞,再用FHV-1 H07感染F81细胞。48 h后在荧光显微镜下观察到有零星红色荧光产生(图3-A),表明红色荧光蛋白RFP得到成功表达。用重组病毒、野病毒混合液进行噬斑纯化,待显微镜下观察有RFP表达的细胞病变占总细胞病变的80%～90%时进行有限稀释及进一步纯化,筛选到有细胞病变处且都有RFP表达的单个孔(图3-B、C),命名此病毒为FHV-ΔgIgE-RFP。
图3 荧光显微镜下gIgE基因缺失重组病毒构建及鉴定
2.4 重组病毒PCR的鉴定结果
提取FHV-ΔgIgE-RFP以及H07基因组DNA,用验证gIgE引物cx-gIgE-F/R进行PCR,电泳结果显示,FHV-ΔgIgE-RFP无任何条带,说明重组病毒已纯化成功,而H07作为阳性对照出现了1条419 bp的目的条带(图4-A)。用验证RFP引物cx-RFP-F/R进行PCR,电泳结果显示,FHV-ΔgIgE-RFP出现1条314 bp的目的条带,说明红色荧光蛋白基因RFP已成功插入FHV-1基因组中并成功表达(图4-B)。将有目的条带的PCR产物测序,结果显示与预期序列一致。
图4 重组病毒的PCR鉴定
2.5 重组病毒与亲本病毒的TCID50
使用Reed-Muench方法计算重组病毒与亲本病毒的病毒滴度(TCID50)。结果显示,亲本病毒的病毒滴度为107.5 mL-1,而重组病毒的病毒滴度为106.5 mL-1,与亲本病毒相比滴度显著下降(P<0.001)。
2.6 重组病毒的稳定性鉴定
将纯化并鉴定成功的重组病毒在铺有F81细胞48孔板中进行10 轮传代,每一代置于CO2培养箱中培养48 h后收获并继续传下一代。结果(图5)显示,从F1—F10,红色荧光蛋白RFP都稳定表达,无减弱现象,说明FHV-ΔgIgE-RFP可稳定表达外源RFP基因。
图5 F1—F10代重组病毒FHV-ΔgIgE-RFP RFP蛋白表达结果
2.7 重组病毒体外生长特性分析
用Reed-Muench方法计算24、48、72和96 h收获病毒液的TCID50,并用GraphPad Prism软件绘制病毒生长曲线。结果(图6)显示:亲本病毒H07在24～48 h快速复制生长,之后复制速度减缓,而重组病毒整体的生长趋势与H07大致相同,表明本试验的这种基因改造并不会改变FHV-1本身的生长特性。
图6 重组病毒与亲本病毒生长曲线
2.8 重组病毒噬斑观察及染色结果
将FHV-ΔgIgE-RFP以及FHV-1 H07接种到铺满F81细胞的6孔板中并加入10 g·L-1低熔点琼脂糖,培养48 h后在显微镜下观察噬斑形态; 培养72 h后取出,用多聚甲醛固定液进行固定后再加入草酸铵结晶紫染色液进行噬斑染色。结果(图7)显示,在病毒感染细胞前、后期,重组病毒的噬斑都小于亲本病毒,说明gIgE基因是FHV-1基因组重要的毒力基因,缺失后毒力降低。
图7 重组病毒与亲本病毒噬斑观察及染色结果
3 讨论
本研究运用同源重组以及CRISPR/Cas9两种基因编辑技术构建疱疹病毒FHV-1重组病毒,sgRNA结合Cas9蛋白可靶向使gIgE基因停止转录、翻译,降低生物活性,使外源基因RFP更容易将其替换,提高了重组效率。缺失gIgE基因后重组病毒毒力减弱,后续可利用此生物学特性构建基于此FHV-1重组病毒的二联或多联致弱苗。例如可以将翻译狂犬病毒的G糖蛋白、杯状病毒的VP1蛋白或者猫免疫缺陷病毒的包膜蛋白基因替换RFP,设计针对RFP的sgRNA,利用反向筛选技术,再通过噬斑纯化以及有限稀释去纯化无RFP表达的二联或多联毒株,为防控猫各种常见且难以控制的病毒性疾病提供借鉴。
纯化带有报告基因的重组病毒最常用的方法就是噬斑纯化,但此方法耗时长,并且不同种病毒从接种细胞开始到挑取噬斑的时间也需要摸索。本试验运用的亲本病毒株FHV-1 H07挑取噬斑的周期一般为 3 d,如果培养时间过短则表达红色荧光的噬斑较小,此时挑取极易取到附近的亲本病毒,不利于纯化; 如果培养时间过长,由于固体培养基的营养已被细胞消耗殆尽,病毒活力也会降低,荧光变弱,给挑取噬斑增加了难度。因此把控好试验周期非常重要。在纯化过程中发现FHV-1 H07的生长速度要远高于重组病毒,所以当重组病毒的纯度达到80%以上时就很难有突破,此时噬斑纯化方法就不适用,改为进行有限稀释后的进一步纯化。将病毒混合液进行高度稀释,就容易获得与亲本病毒完全分离开的重组病毒粒子,后续只需进行几轮接种培养,即可获得纯化的重组病毒。因此,前期做噬斑纯化的重组病毒纯度越高,后续做有限稀释筛选出纯化的重组病毒的概率也会提高,缩短纯化时间。
本研究运用同源重组以及CRISPR/Cas9技术成功构建FHV-1 gIgE基因缺失株FHV-ΔgIgE-RFP,并验证此毒株可稳定传代且其毒力降低,而生长趋势与FHV-1亲本病毒大致相同。
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