研究简介
本研究旨在解决根管治疗中消毒剂有效评估的关键临床需求。在根管治疗中，致病真菌如白色念珠菌是导致持续感染的重要原因。传统评估消毒剂（如葡萄糖酸氯己定、次氯酸钠、过氧化氢）效果的方法主要基于“生长抑制”，即以最小抑菌浓度 为指标，但此方法耗时较长且无法区分杀菌与抑菌状态，更无法检测“非生长但代谢活跃” 的细胞。NGMA细胞是导致潜伏或复发性感染的潜在根源。消毒剂在根管治疗中起着至关重要的作用，根管内微生物的代谢活动可能引发难治性感染。
为研发高效对患者和环境友好的消毒剂配方，本研究以白色念珠菌为病原模型，通过重水探针单细胞拉曼光谱技术，定量评估根管消毒剂的代谢抑制效果。葡萄糖酸氯己定、次氯酸钠和过氧化氢的最低抑菌浓度分别为4mg/mL、168mg/mL和60μg/mL，在该浓度下，尽管真菌的生长被完全抑制，但作用8小时后，单个真菌细胞的代谢活性平均仅分别下降0.4%、93.9%和94.1%，这一现象揭示了真菌存在“非生长但代谢活跃”的状态，该状态可能是难治性感染发生的潜在原因，其中葡萄糖酸氯己定的该现象尤为显著。
与之相反，在基于代谢活性的最低抑菌浓度下(葡萄糖酸氯己定8μg/mL、次氯酸钠336μg/mL、过氧化氢120μg/mL)，持续作用8小时后，所有真菌细胞的代谢活性均被完全抑制。此外，将次氯酸钠与过氧化氢按各自0.5倍基于代谢活性的最低抑菌浓度联合使用时，其抑菌效果优于单独使用葡萄糖酸氯己定、次氯酸钠、过氧化氢，也优于其他二元组合方式。同时，单细胞拉曼光谱的动态变化揭示了葡萄糖酸氯己定、次氯酸钠、过氧化氢及其两两组合具有截然不同的杀真菌作用机制。基于代谢活性的最低抑菌浓度在精准评估抗真菌效果方面具有显著优势，而次氯酸钠与过氧化氢的组合有望成为针对病原真菌的更高效消毒剂配方。
Bioscreen 全自动生长曲线分析仪的应用
将稳定期的白色念珠菌培养液按1:100稀释，分别暴露于终浓度为0%、10%、20%、30%、40%、50%的重水环境中。利用Bioscreen C全自动生长曲线分析仪中培养白色念珠菌，追踪不同重水浓度下真菌的生长情况。每孔工作体积为300μL，培养温度37℃，检测波长600nm；仪器每30分钟自动读取一次光密度值，实验周期10小时，每次检测前样品轻柔振荡10秒。同时，在不同时间点取样，获取单细胞拉曼光谱，检测白色念珠菌对重水的摄入情况。通过比较不同消毒剂浓度下生长曲线的形态（如是否出现指数增长期、达到稳定期的时间等），研究人员可以直观判断细菌生长是否被抑制。通过分析Bioscreen生成的大量生长曲线数据，研究团队精确测定了CHX、NaClO和H₂O₂对白色念珠菌的MIC值，分别为4 μg/ml、168 μg/ml和60 μg/ml。
实验结果
研究确立了“基于代谢活性的最小抑制浓度”（MIC-MA）这一新参数，其相较于传统的“最小抑制浓度”（MIC）能更精准、严格地评估消毒剂效能。MIC-MA能够有效识别并量化传统方法所忽略的“非生长但代谢活跃”（NGMA）的细胞状态，而这种状态是导致感染潜伏与复发的关键潜在因素。研究揭示了在传统MIC浓度下使用消毒剂可能存在的临床风险。数据表明，即使在完全抑制生长的MIC浓度下，三种消毒剂均未能完全遏制真菌的代谢活性。
尤为突出的是，葡萄糖酸氯己定（CHX）在其MIC（4 μg/ml）下，对代谢的抑制率极低（仅0.4%），表明绝大多数细胞仍存活并保持代谢，存在较高的治疗失败隐患。研究发现次氯酸钠（NaClO）与过氧化氢（H₂O₂）联合使用具有显著的协同增效作用。当两者以各自0.5倍MIC-MA的浓度组合时，其对真菌代谢的完全抑制效果等同于任一成分单独使用其全量MIC-MA的效果。本研究验证了单细胞拉曼光谱作为一种快速、定量、具有单细胞分辨率的强大工具，在抗菌效能评估与机制研究中的巨大潜力。该方法不仅能通过MIC-MA提供更可靠的药效指标，还能通过“拉曼应激反应条形码”（RBCS）揭示不同消毒剂的作用机制差异
图1、 白色念珠菌的重水标记单细胞拉曼显微光谱检测结果。(A)不同重水浓度下白色念珠菌光密度600 nm值的时间变化趋势；(B)重水浓度递增条件下单细胞拉曼光谱(SCRS)的变化：将白色念珠菌培养于添加不同浓度重水的培养基中，过夜培养至稳定期后采集单细胞拉曼光谱；(C)白色念珠菌碳-氘(C-D)比值与重水浓度的相关性：将实验菌株分别在一系列不同重水浓度条件下培养，继续培养12 h后测定单细胞拉曼光谱；(D)30%重水条件下白色念珠菌单细胞拉曼光谱的时间变化：无药物培养体系中，单细胞拉曼光谱的碳-氘特征峰呈渐进式出现，该现象显著；(E)30%重水条件下白色念珠菌碳-氘比值与光密度600 nm值的时间变化：碳-氘比值曲线与基于光密度600 nm值的生长曲线存在明显差异。
图2 、三种根管消毒剂各自的基于代谢活性的最低抑菌浓度(MIC-MA)检测结果。(A–C)葡萄糖酸氯己定(CHX)、次氯酸钠(NaClO)、过氧化氢(H2O2)的不同剂量对白色念珠菌细胞碳-氘比值变化值(ΔC-D)的影响；(D–F)葡萄糖酸氯己定、次氯酸钠、过氧化氢的剂量递增条件下，白色念珠菌碳-氘(C-D)比值的时间动态变化。
图3 、三种根管消毒剂各自最低抑菌浓度(MIC)下白色念珠菌的代谢活性检测结果。(A)最低抑菌浓度下白色念珠菌碳-氘(C-D)比值的时间动态变化；(B)葡萄糖酸氯己定(CHX)、次氯酸钠(NaClO)、过氧化氢(H2O2)在最低抑菌浓度下作用8 h后，白色念珠菌的代谢活性抑制程度。每个散点代表单个细胞。
图4 、不同消毒剂组合对白念珠菌细胞代谢活性抑制的比较。显示了白色念珠菌在单一消毒剂或CHX和H2O2(A)、CHX和NaClO(B)或NaClO和H2O2(C)组合下的C-D比值的时间动态。(D)NaClO+H2O2的组合优于CHX+H2O2或CHX+NaClO的组合。´：0.25×MIC-MA；´´：0.5×MIC-MA。。
图5、 不同消毒剂暴露时间下细胞对应激反应(RBCS)的拉曼条形码。显示了在单一CHX(A)、NaClO(B)、H2O2(C)或CXH和NaClO的组合(D)、CHX和H2O2(E)、NaClO+H2O2(F)下标记拉曼带的变化趋势。拉曼带强度的变化以D值计算(在应激细胞和对照细胞之间)，并显示为蓝色(强度降低)或红色。
总结
本研究旨在解决根管治疗中消毒剂有效评估的关键临床需求。在根管治疗中，真菌如白色念珠菌是导致持续感染的重要原因。传致病统评估消毒剂（如葡萄糖酸氯己定、次氯酸钠、过氧化氢）效果的方法主要基于“生长抑制”，即以最小抑菌浓度 为指标，但此方法耗时较长且无法区分杀菌与抑菌状态，更无法检测“非生长但代谢活跃” 的细胞。NGMA细胞是导致潜伏或复发性感染的潜在根源。本研究引入并应用了一种基于代谢活性评估的新型方法。D2O标记的单细胞拉曼光谱 技术。其核心原理是，活细胞代谢时会摄入培养基中的重水，并在其拉曼光谱的碳-氘 振动区产生特征信号，信号强度与细胞代谢活性成正比。基于此，研究定义了基于代谢活性的最小抑制浓度 ，即能够将细胞群体代谢活性完全抑制至基线水平的最低药物浓度。
本研究证明了基于D2O的单细胞拉曼光谱技术能够快速、定量、在单细胞分辨率水平评估消毒剂对病原真菌代谢活性的抑制效果。所提出的MIC-MA参数比传统MIC更能精准反映消毒剂彻底阻断代谢的能力。研究发现NaClO与H2O2的组合是一种高效的低剂量协同配方。这项工作为基于代谢抑制而非生长抑制的抗菌效能评估提供了新方法，并为开发更高效、低副作用的个性化根管消毒方案奠定了基础。研究的主要创新点在于引入了基于代谢活性（MIC-MA）的新评估参数，但这需要与传统的基于生长抑制的“金标准”（MIC）进行对比验证。
Bioscreen C全自动生长曲线分析仪高效、准确地提供了这些关键的基准数据，为新方法的有效性建立了参照系。因为研究需要测试多种消毒剂在不同浓度下的效果，Bioscreen C全自动生长曲线分析仪一次可同时监测多达200个样品，并确保所有样品在完全一致的培养条件下（温度、振荡）接受连续监测，极大提高了实验效率和数据的一致性，避免了手工取样和测量带来的误差。通过分析Bioscreen生成的大量生长曲线数据，研究团队精确测定了CHX、NaClO和H₂O₂对白色念珠菌的MIC值，分别为4 μg/ml、168 μg/ml和60 μg/ml。
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