4. 讨论与结论
PknB已被证明可调节细菌分裂、生长和细胞壁生物合成。本研究提出的数据表明，PknB介导的信号通路可以通过外部PknB_PASTA结构域靶向。过表达PknB_PASTA结构域延迟了结核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌的再生长。通过添加高浓度的Mg2+可以改善生长抑制，但胞壁肽则不能。Mg2+离子对所有生物都至关重要，其浓度可能变化，在原核细胞中高达20 mM，在真核细胞中高达100 mM。
在革兰氏阴性细菌中，镁离子稳定外膜，并在革兰氏阳性细菌的细胞壁中以高浓度存在，它们将二价离子结合到其磷壁酸上。分枝杆菌不具有磷壁酸，镁离子在分枝杆菌细胞壁中的结合尚未详细研究，尽管镁离子改善了分枝杆菌在低pH培养基中的生长。缺失某些肽聚糖结合蛋白的枯草芽孢杆菌突变体的生长在高Mg2+水平下得到改善，表明二价金属可以补偿由于肽聚糖生物合成改变引起的生长缺陷。
镁对TMP菌株生长的确切机制尚不清楚。Mg2+离子可以稳定细胞膜和与膜相关的蛋白质复合物，这些复合物因过表达PknB_PASTA结构域而受到干扰，尽管也有可能Mg2+离子直接结合到肽聚糖的生长链上并促进其聚合。进一步剖析PknB_PASTA过表达抑制效应的分子机制将有助于我们理解PknB及其胞外结构域的生物学功能，以及Mg2+离子在细胞壁结构中的作用。三种可能的情景可以解释与PknB_PASTA过表达相关的观察到的效应。过表达的PknB_PASTA与天然PknB竞争配体，从而干扰PknB介导的信号通路。PknB_PASTA结构域与青霉素结合蛋白相互作用并扰乱肽聚糖生物合成。最后，高丰度的PknB_PASTA可能通过结合生长链直接破坏肽聚糖的结构，并物理上阻止延伸和交联。
图7. PknB_PASTA介导生长抑制的可能机制示意图。(a)在 TMP 菌株中，过表达的PknB_PASTA与天然PknB竞争肽聚糖配体，并干扰PknB介导的信号传导。(b)过表达的PknB_PASTA与青霉素结合蛋白结合，导致肽聚糖聚合失调。(c)过表达的PknB_PASTA与肽聚糖结合并破坏其结构稳定性。 PGS ：肽聚糖合成复合体。
PknB的调节功能是进化来协调细胞壁生物合成和分裂的。事实上，最近发表的一项研究确定，PknB通过招募FhaA和磷酸化MviN来协调肽聚糖合成复合物的组装。在单核细胞增多性李斯特菌中，灭活含有PASTA的激酶导致对β-内酰胺类抗菌剂的敏感性增加，就像TMP菌株一样，可能由于PknB功能的部分失活而对β-内酰胺类抗菌剂表现出高敏感性。然而，虽然PknB突变体会裂解且无法生长，但TMP菌株仅在延长的滞后期形式中表现出初始的生长障碍，但在指数期能够正常生长。因此，除了干扰PknB功能外，其他因素也可能导致TMP菌株的生长表型。
PknB_PASTA与青霉素结合蛋白可能的直接相互作用与最近的研究结果一致，即肺炎链球菌的StkP激酶的PASTA结构域能够结合青霉素结合蛋白2x。我们也不能排除PASTA结构域通过与肽聚糖直接相互作用来改变细胞壁的结构，正如先前在体外观察到的。本研究的结果可能表明，过表达的PknB_PASTA结构域与生长的肽聚糖链相互作用，并可能在物理上干扰其交联，最终导致过表达菌株对美罗培南、克拉维酸和氨苄西林的更高敏感性。已显示美罗培南抑制DD-羧肽酶和LD-转肽酶活性，并且与克拉维酸联合使用时对生长和持续存在的分枝杆菌具有高活性。
我们的发现与先前提出的PknB_PASTA的肽聚糖传感作用一致。需要进一步研究来阐明PknB_PASTA结构域是识别肽聚糖生长区域中存在的特定结构从而激活催化结构域的二聚化，还是在支持生长中的肽聚糖和确保PknB的正确定位方面发挥更结构性的作用。过表达PASTA结构域截短形式的菌株没有明显的生长缺陷，表明需要四个PASTA单元和跨膜区域来实现PknB功能。
去除跨膜部分导致PASTA结构域的错位。尽管单个PASTA单元的确切作用有待阐明，但我们的数据与先前的观察一致，即缺失一个或多个PASTA结构域的截短PknB无法互补条件性pknB突变体。目前也不清楚PASTA结构域是否能感知分枝杆菌在生长过程中释放的短胞壁肽。在我们的实验中，我们观察到肽聚糖对PASTA过量产生引起的生长抑制仅有非常微弱的影响，并且外部添加的胞壁肽没有刺激生长或复苏。
可能特定的胞壁肽是激活PknB和随后复苏所必需的，因为胞壁肽已被证明具有复苏刺激活性。可以想象，PASTA结构域可能通过感知体内肽聚糖的重排，并调节细胞壁生物合成，直接参与复苏。使用固态NMR和用于活细菌显微镜检查的探针进行监测肽聚糖重排以及外部PASTA结构域与茎肽聚糖相互作用的额外实验，将使我们能够建立精确的PknB介导的传感机制。