本文旨在以海区具有代表性的优势海洋细菌浓度加富的方法,选用防污涂料中广泛使用的防污剂和实验室自制防污剂为受试化合物,以凝胶板模拟涂层进行室内模拟浅海挂板,以探索基于海洋细菌生长曲线变化。


测定OD值并绘制OD-t生长曲线


取200μL各受试菌悬液于96孔板中,分别向各孔板中加入1μL不同浓度的防污剂,以加入1μL纯溶剂DMSO的孔板作为对照,以添加对应浓度防污剂的液体培养基作为空白,用酶标仪在600nm波长下测定其OD值(杨浩等,1996;乔军等,2002;马勇等,2011)。将96孔板置于25°C培养箱中培养24 h,期间每隔1—2 h测定并记录菌悬液的OD值,绘制3种受试菌在不同条件板孔中的生长曲线,得到各种防污剂的最小抑制浓度MIC。


受试菌的生长曲线及MIC


3种受试菌在几种不同浓度防污剂溶液影响下的生长曲线,可以很直观地反应出5种试验防污剂的抑菌效果(Marionet al,2008),见图1、图2、图3、图4、图5。


由图1—图5可以看出,随着防污剂CPT、TBTO和ZPT浓度的升高,3种受试菌的生长逐渐受到抑制,当溶液浓度达分别到0.97×10–3mg/mL、1.99×10–3mg/mL和1.91×10–3mg/mL时,三种防污剂对受试菌均表现出明显的抑制作用。

图1 CPT对三种受试菌生长曲线的影响

图2 TBTO对三种受试菌生长曲线的影响

图3 ZPT对三种受试菌生长曲线的影响

图4 DCDMA对三种受试菌生长曲线的影响

图5 Diuron对三种受试菌生长曲线的影响


对于CPT,整体来看,其抑菌性随浓度增加而增加。但是,当浓度达到0.97×10–3mg/mL后,继续增大浓度,抑菌效果仅有轻微增加;并且随时间延长,受试菌呈平稳生长状态;对于TBTO,在各个试验浓度下,均表现出了很好的抑菌效果,且浓度变化对抑菌效果影响不大。但随时间的延长,在17.5h时,受试菌生长速率明显加快,这或许和细菌的生长周期有关;对于ZPT,在浓度低于1.91×10–3mg/mL时,抑菌效果不是太明显,当浓度达到1.91×10–3mg/mL时,才表现出明显的抑菌性,继续增大浓度对其影响不大。


由图3可以看出,当溶液浓度达到8.46×10–3mg/mL时,DCDMA才对三种受试菌表现出轻微的抑制作用,但当浓度继续增加时,抑菌效果并没有增加,这可能是因为溶液中的DCDMA已达到饱和状态。相较于前三种防污剂,DCDMA的防污效果并不十分显著。


由图5中3种受试菌的生长曲线可以看出,Diuron对海洋细菌的正常生长几乎没有影响,当浓度高达0.493mg/mL时,依然没有明显抑制作用。印证了前面室内挂板的结果。


结果


测定OD-t生长曲线的方法,在杀菌剂的检测中已经得到应用(孙世春等,1999;陈默等,2009)。此法在本研究中作为一种辅助方法,不但对防污剂的防污效果做出了定量的大小比较,而且对防污剂在实际防污涂料中的用量问题,给予一定的参考值。室内短期挂板实验,采用几种菌在海水中混合培养的人工加富浓度模式,与实海(浅海挂板)情况更接近,比测试单一某种菌种的抑菌性更具实际意义,且其24h抑菌率与OD-t生长曲线法所得结果一致。因此,本研究方法对于海洋防污剂的评价具有可靠性。


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