2.9噬菌体A149的治疗评价
按照图7A的流程进行噬菌体A149对小鼠肠道VRE定殖的治疗；对治疗后小鼠粪便中的肠球菌进行计数以评价A149的治疗效果，结果如图7B所示，经过混合抗生素处理和V583感染后，V583可在小鼠肠道实现短期稳定的定殖(第1、2天)，粪便中肠球菌载量可达109 CFU/g左右。在使用噬菌体A149治疗之后，治疗组与对照组(BHI处理)在2 d后(第3、4天)均有显著差异，治疗组在第二天可降低1.3个数量级的V583载量。但V583不能继续在对照组的小鼠肠道中实现高载量的稳定定殖，在V583感染后第5−7天发生显著降低；治疗组与对照组在第5−7天的细菌载量无显著性差异。该结果证实A149可在感染初期有效降低V583在小鼠肠道中的定殖。
图7噬菌体A149对小鼠肠道VRE感染的治疗评价A：噬菌体A149对小鼠肠道VRE感染的治疗流程图。−12、−10、−9、−3分别表示耐万古霉素Efs V583感染前12 d、10 d、9 d以及3 d。Abx为AntiBiotics简称。B：噬菌体A149治疗后粪便中的粪肠球菌计数。
小结
噬菌体A149基因组不含抗生素抗性基因和毒力基因，在体外可有效抑制粪肠球菌生长达11 h，对所测试的粪肠球菌具有86.4%的裂解能力(51/59)，在小鼠肠道感染模型中可降低粪肠球菌约1.3个数量级。
3、讨论
多重耐药性肠球菌的感染是当前临床上一个突出的治疗挑战，其中，院内感染最为常见的肠球菌是屎肠球菌和粪肠球菌。相较于屎肠球菌，粪肠球菌的毒力往往更强，引起菌血症的同时也可能伴有心内膜炎[18]。因此，耐药粪肠球菌尤其是耐万古霉素粪肠球菌的感染严重威胁着人类健康和公共卫生安全。噬菌体作为一种历史悠久的天然抗菌剂，在后抗生素时代再次受到人们的重视，在治疗多重耐药菌感染的方面具有巨大的应用潜力；已有临床案例证实，噬菌体可成功治疗多重耐药性细菌感染[19]。目前，国内外对粪肠球菌噬菌体的研究相对有限，亟须进一步筛选和研究其噬菌体的生物学特性，为建立粪肠球菌感染的噬菌体防控策略提供科学基础。
本研究分离出一株针对耐万古霉素粪肠球菌V583的噬菌体A149，其最佳感染复数为0.001，潜伏期短(≤5 min)，暴发量高(约912 PFU/cell)，在生长特性上优于之前报道的肠球菌短尾噬菌体Ideix和vB_EfaP_IME195[9,20]。A149可在较宽的温度范围(20−50℃)和pH范围(4.0−10.0)稳定存活，基因组不含抗生素抗性基因和毒力基因，具有应用于治疗粪肠球菌感染的潜力。此外，A149对粪肠球菌菌株的裂解谱为86.4%(51/59)，在种内具有良好的广谱性；对屎肠球菌(0/5)、单核增生李斯特氏菌(0/2)、金黄色葡萄球菌(0/2)和大肠杆菌(0/2)等均无裂解效果，具有良好的特异性。一般认为，短尾噬菌体的裂解谱较肌尾噬菌体(Myoviridae)和长尾噬菌体(Siphoviridae)窄[21]，但噬菌体A149表现出相对较广的裂解谱，有研究也表明肠球菌短尾噬菌体Ump比肌尾噬菌体CCS1和长尾噬菌体CCS2、CCS3、CCS4表现出更广泛的裂解谱[22]，表明肠球菌短尾噬菌体的裂解谱可能相对较广。
VRE肠道定殖是住院患者院内感染的主要来源，因此我们模拟住院患者抗生素治疗后耐药肠球菌大量增殖造成肠道感染的特征构建了小鼠模型，并测定了噬菌体A149对VRE肠道定殖的清除效果。相较于对照组，A149在治疗后第2天可显著降低V583定殖，减少约1.3个数量级，具有良好的体内治疗效果。但A149并未实现对肠道内V583的完全清除，噬菌体抗性菌的产生是其中的一个原因，体外抑菌曲线也显示在11 h之后抗性菌开始进入生长期(图6)。有研究表明噬菌体抗性菌株的产生是噬菌体不能根除肠球菌肠道感染的原因之一[23]，证实了噬菌体抗性菌株是噬菌体疗法的局限性之一。本研究中的粪肠球菌V583是耐万古霉素粪肠球菌，所以具有抗生素和噬菌体双重抗性的细菌可能已被选择出来，并成为优势感染的菌群，进一步增加了治疗难度。有研究表明，一些耐药菌株在获得噬菌体抗性的同时会出现对部分抗生素的再次敏感，因此噬菌体与抗生素的联合使用具有协同抗菌作用，是一种值得探究的联合抗菌策略[24]。此外，噬菌体“鸡尾酒”疗法通过复配不同类型或不同受体的噬菌体形成组合，可以在一定程度上有效消除噬菌体抗性，并具备比单株噬菌体更强的杀菌能力，是噬菌体疗法的主要研究方向之一[25]。今后的研究应致力于筛选更多的粪肠球菌噬菌体，并开发高效、广谱的噬菌体“鸡尾酒”疗法，为耐药粪肠球菌感染的防控提供新的策略。
4、结论
本研究从污水样本中分离出一株可高效裂解耐万古霉素粪肠球菌V583的短尾噬菌体A149，经过对其形态学观察、生物学特性研究以及体内外抑菌实验，表明该噬菌体具有较广的裂解谱以及较好的抑菌作用，是治疗耐万古霉素粪肠球菌的有效生物资源，对于粪肠球菌感染的“无抗”防控具有重要的意义。