LTA的作用
先前有研究表明脂磷壁酸参与乳杆菌菌株在小鼠胃上皮的生物膜形成以及约氏乳杆菌La1对人肠上皮样Caco-2细胞的粘附。磷壁酸占革兰氏阳性细菌细胞壁干重的50%，而LTA的D-丙氨酰酯取代与表面电荷直接相关。我们最近表明，编码LTA合成重要酶之一的基因的插入失活导致LTA中D-丙氨酰酯的完全缺失，并改变了鼠李糖乳杆菌GG的不同细胞表面特性。在此，研究了dltD突变体CMPG5540在不同培养条件下的生物膜形成能力。令人惊讶的是，与金黄色葡萄球菌和粪肠杆菌中的类似突变相反，鼠李糖乳杆菌GG dltD突变体显示出更多的生物膜形成，尤其是在mTSB培养基和无葡萄糖的MRS培养基中。
LuxS和中心代谢的作用
LuxS的活性由于其在种间信号分子AI-2生物合成中的作用而在病原菌中与生物膜形成相关被广泛研究。在S-腺苷甲硫氨酸的循环中，LuxS酶催化S-核糖同型半胱氨酸的转化，产生AI-2和同型半胱氨酸。然而，由于LuxS酶构成了活化甲基循环以及甲硫氨酸和半胱氨酸氨基酸代谢的一个组成部分，对luxS突变体表型的分析是多方面的。先前我们已经表明，鼠李糖乳杆菌GG luxS突变体CMPG5412在AOAC培养基中的生物膜形成受到影响。然而，这种缺陷不能通过添加信号分子AI-2来互补，但可以用半胱氨酸进行营养互补。在本研究中，我们比较了CMPG5412在本研究使用的不同培养基中的生物膜形成能力。luxS突变体的生物膜缺陷是培养基依赖性的。在氮源丰富的环境如mTSB培养基中，CMPG5412在生物膜形成方面没有受损，这与AOAC培养基中的情况相反。这与我们先前发表的结果一致，表明CMPG5412的生物膜缺陷具有重要的代谢性质，而不仅仅是由于AI-2介导的通讯中断。
讨论
益生菌株的定植能力通常通过使用粘液或肠上皮细胞系在体外进行研究。这些模型代表了摄入的益生菌初始附着于肠壁的情况，但不适合研究定植中更动态的后续步骤，即微菌落形成和向生物膜样群落的结构发育。评估不同培养基中的生物膜形成是更好地理解细菌适应环境胁迫和定植不同生态位机制的补充方法。本文报告，经过广泛研究的益生菌株鼠李糖乳杆菌GG能够在体外形成生物膜，而测试的相关乳杆菌则不能。此外，我们研究了几种影响生物膜形成的因素。据我们所知，本研究构成了迄今为止发表的最广泛的乳杆菌体外生物膜形成分析。
从我们的比较分析可以得出结论，鼠李糖乳杆菌GG固有的生物膜形成能力强烈依赖于环境因素和所使用的培养基。总的来说，生物膜形成的程度与悬浮生长之间存在反比关系。营养限制，特别是可发酵碳源的低可用性，如在具有低C/N比的mTSB培养基中，刺激了鼠李糖乳杆菌GG的生物膜生长。然而，生长限制似乎不足以诱导乳杆菌菌株的生物膜形成，正如其他乳杆菌菌株的比较研究所显示。
决定鼠李糖乳杆菌GG良好生物膜形成能力的潜在遗传因素仍有待表征，因为它可能由多种遗传途径介导。在本研究中，我们调查了EPS、LTA和中心代谢的作用。在大多数细菌中，EPS产生对生物膜形成很重要。虽然鼠李糖乳杆菌GG在MRS培养基中不被称为高产EPS者，但我们在本研究中证明鼠李糖乳杆菌GG的EPS产生高度依赖于培养基。EPS在鼠李糖乳杆菌GG生物膜形成中的重要性似乎取决于培养条件。事实上，AOAC培养基诱导了最高的EPS产量，而最好的生物膜形成在mTSB培养基中观察到。此外，显示鼠李糖乳杆菌GG的wzb敲低突变体在AOAC培养基中的生物膜形成特别受损。因此，EPS产生显然不是决定鼠李糖乳杆菌GG生物膜形成的唯一因素。例如，除了EPS产量，聚合物大小以及EPS分子的特定化学结构和组成也可能影响生物膜形成。此外，除了EPS，其他表面成分很可能也参与生物膜形成，正如dltD突变体所例证。虽然dltD失活导致表面负电荷增加，但我们观察到在聚苯乙烯上形成更多的生物膜，这取决于培养基。这可能是由于改变的LTA对生物膜发育的间接影响。例如，磷壁酸中D-丙氨酰酯的缺失已被证明可改变枯草芽孢杆菌外蛋白的折叠，并导致戈登链球菌大表面蛋白粘附素的丢失。改变表面蛋白可能导致细胞表面理化性质的改变。此外，中心代谢的差异也可能部分解释乳杆菌菌株间生物膜形成能力的变化，正如罗伊氏乳杆菌和鼠李糖乳杆菌GG luxS突变体对比鲜明的生物膜表型所例证。
乳杆菌的生物膜存在于许多自然环境中。由于胃肠道是益生菌的重要靶点，本研究调查了与此生态位相关的一些因素。我们的数据显示，诸如低pH、高渗透压以及胆汁和粘蛋白存在等条件高度调节鼠李糖乳杆菌GG的生物膜形成，但每种因素的影响取决于微环境。一些因素如粘蛋白可能促进鼠李糖乳杆菌GG与底物的结合。鼠李糖乳杆菌GG甚至先前被证明可诱导粘蛋白表达，这可能是表面调节微生境以增加其定植能力的一种方式。
此外，鼠李糖乳杆菌GG具有优异的体外粘液粘附特性，这在许多乳杆菌中由特定的粘液结合蛋白介导。在促进EPS的AOAC培养基中，粘液的生物膜促进效应不那么明显，这可能是由于这些粘液结合蛋白被EPS屏蔽。此外，未消化的食物颗粒可能影响肠道微生物群的结构排列。鼠李糖乳杆菌GG因菊粉而观察到的生物膜形成增加似乎是由于聚集的刺激。这些复杂的多糖可能被整合到细胞外基质中，从而增强生物膜形成。其他因素如pH和胆汁酸可能极大地影响鼠李糖乳杆菌GG本身的细胞表面，从而影响生物膜发育。在不影响生长的浓度下，胆汁刺激了鼠李糖乳杆菌GG的生物膜形成。正如对霍乱弧菌所示，胆汁可能是鼠李糖乳杆菌GG在小肠中形成生物膜的一个信号。在未来研究中调查鼠李糖乳杆菌GG在胆汁存在下的差异基因表达将是有意义的。在一些细菌中，胆汁诱导了特定粘附素如EPS和菌毛样附属物的表达。此外，鼠李糖乳杆菌GG的生物膜形成对低pH比悬浮生长更敏感，正如戈登链球菌也有报道。然而，生物膜形成是一个复杂的过程。
本研究中使用的结晶紫方法评估了初始细菌粘附和生物膜成熟的最终结果。很可能低pH刺激初始粘附，正如对上皮细胞粘附所示，但成熟生物膜的发育被低pH抑制。有趣的是，一些乳杆菌能够以生物膜样群落定植于啮齿动物的酸性胃中。这清楚地表明，需要进一步的研究，包括体内成像，以调查外源施用和内源乳杆菌在不同区域和生态位中的生物膜形成能力。