2方法及结果
2.1枯草芽孢杆菌培养液制备
将枯草芽孢杆菌的胰酪大豆胨液体培养基置35℃培养24h,取以上新鲜培养物1mL,用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-3~10-7,做活菌计数备用。
2.2不同水活度培养基的配制
参照USP<1112〉表1.微生物生长所需的最低水分活度(aw),枯草芽孢杆菌的最低水分活度(aw)是0.90{}^{[4]}。分别使用氯化钠、蔗糖、甘油3种水分活度调节剂,调节TSB水分活度在枯草芽孢杆菌的最低水分活度附近，即低于水分活度限值0.01单位、水分活度限值和高于水分活度限值0.01单位，以及没有调节水分活度的TSB,分别用T{}_{L}、T、T_{H}和T。表示。3种调节剂使用量见表1。
2.3绘制枯草芽孢杆菌生长曲线
取“2.1”项下制备的菌悬液(每1mL含约10 cfu)1 mL加入到“2.2”项下配制的培养基中，使得各种培养基中菌液浓度约每1 mL含100 cfu,T、T、T_{H}为实验组,T_{0}为对照组。
将加菌后的T_{L}、T、T_{H}和T_{0}置35℃培养,分别在0、2、4、6、8、12、36、48、75、104和144h时间点，取1 mL接种置平皿中,倾注TSA,于35℃培养48h,每个时间点每组平行测定2个平皿，计数。再将测得的菌落数(cfu)取对数值和相应时间点作图,绘制生长速率曲线，每个验证实验分别进行3次。
2.4实验结果
2.4.1氯化钠调节介质
以氯化钠做水分活度调节介质，各水分活度下枯草芽孢杆菌的生长曲线见图1~4。
2.4.2蔗糖调节介质
以蔗糖做水分活度调节介质,各水分活度下枯草芽孢杆菌的生长曲线见图5~7。
2.4.3甘油调节介质
以甘油做水分活度调节介质,各水分活度下枯草芽孢杆菌的生长曲线见图8~10。
根据上述实验所得数据及生长曲线可以看出，在(aw)=0.91水分活度条件下,枯草芽孢杆菌在氯化钠、蔗糖2种介质中的生长曲线趋势基本一致，在24h后进入快速增长期，菌浓度明显增加。在甘油介质中，枯草芽孢杆菌从32h开始明显生长。
在(aw)=0.90水分活度条件下,上述3种介质的枯草芽孢杆菌生长曲线趋势基本一致，都在50h后快速增长。在(aw)=0.89水分活度条件下,3种介质调节的培养基中，枯草芽孢杆菌数最后都接近或降为0,生长曲线趋势均为逐渐下降,说明该水分活度条件下枯草芽孢杆菌的生长受到抑制。根据以上实验数据，基本可以验证0.90是枯草芽孢杆菌生长所需的最低水分活度值。通过对氯化钠、蔗糖、甘油3种介质在不同水分活度水平下微生物的持续监测，可以看出水分活度会影响微生物的生长情况。微生物生长是水分活度、温度、营养条件等各方面环境因素综合作用的结果。在温度、营养条件相同的情况下，调节水分活度可以影响微生物的生长。
3讨论
目前水分活度概念已经作为预测微生物生长，反映产品稳定性和安全性的参数。水分活度影响微生物的代谢，微生物的繁殖、孢子的萌发和生存都需要可利用水。每种微生物都有一个(aw)临界值，在(aw)较高时,微生物生长繁殖快,在低于(aw)临界值时，微生物生长缓慢甚至停止生长。因此,通过测量和控制产品的水分活度可以减少或消除微生物的增殖风险。目前《美国药典》、《欧洲药典》、《日本药局方》都提出了降低药品水分活度对预防潜在微生物的概念，我国水分活度主要应用在食品保存方面在药品安全方面应用较少。
本实验参考USP41<1112>“水分活度测定在非无菌产品中的应用”中表1(以下简称USP1112表1)所列，及《中国药典》2015年版微生物限度检查法中常用代表菌株，选择枯草芽孢杆菌作为研究对象。USP1112表1中提供了在25℃时一系列与制药相关的代表性微生物生长所需的最低水分活度left((aw)right)^{[2]},枯草芽孢杆菌的最低水分活度((aw))为0.90,Hosono等[16]的研究结论与USP收载的结果并不一致。本实验旨在对枯草芽孢杆菌生长所需最低水活度进行研究与验证。查阅文献[1,6,8,17]水分活度使用较多的有甘油、氯化钠、葡萄糖、乙二醇、山梨糖醇等，基于调节剂的食用安全性及易获得性考虑，选取氯化钠、蔗糖、甘油分别作为本实验的水分活度调节剂。微生物对水分活度非常敏感，微小的波动即会影响其生长。将(aw)调节为0.89、0.90、0.91作为枯草芽孢杆菌的生长条件，重复实验3次，重现性较好。
水分活度的测定采用露点/冷面镜法，该法具有精确度高、检测速度快等特点[18]。水分活度测定受环境影响较大，因此在恒温、恒湿的环境中检测结果较为稳定。培养基灭菌前、灭菌后水活度变化在±0.01内。由于培养基装于带塞锥形瓶中，处于封闭状态，湿热灭菌对培养基水分活度影响不大。
本实验绘制各介质中不同水分活度的时间生长曲线。验证枯草芽孢杆菌最低水分活度为0.90。在枯草芽孢杆菌为最大潜在污染物的药品中，可以通过优化处方、包装材料或储存方式，设计和控制药品水分活度，降低微生物增殖风险，提高药品的安全性和稳定性，对于节约药品成本，提高检验效率，提升产品质量具有重要的指导意义[19]。
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