后生元（Postbiotics）是指对宿主健康有益的无生命微生物和/或其成分的制剂，其所用的菌株，必须是经过安全评价、证实可供食用的菌种，主要从肠道或发酵食品中分离获得。由于具有抗菌、抗氧化等功能特性，后生元在食品品质改良、保健品、食品脱毒等领域广泛应用。在后生元来源菌株中，副干酪乳杆菌因其显著的抑菌效果而备受关注。研究表明，副干酪乳杆菌发酵上清液（cell-freefermentationsupernatant，CFS）对多种真菌（如霉菌、红酵母、白色念珠菌）具有显著抑制作用。副干酪乳杆菌p6发酵液对10种细菌和1种真菌具有抗菌活性，有效延缓饼干中过氧化物值和丙二醛含量的上升。在肉类保鲜方面，副干酪乳杆菌与两种乳酸菌混合液使猪肉中单增李斯特菌数量降低20%；而菌株FX-6的发酵提取物对常见食源性致病菌（金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌）、水产致病菌及霉菌均表现出强抑制作用，将鲜虾货架期从6d延长至8d。此外可与其他保鲜技术协同使用大大提升保鲜效果，例如副干酪乳杆菌H9与海藻酸钠复合涂膜处理鱼肉，比单独涂抹H9菌株延长保鲜期4d；Danza等将副干酪乳杆菌与气调包装、冷藏技术结合，延长了汉堡保质期4d。这些研究充分证实，副干酪乳杆菌及其后生元在食品防腐保鲜领域拥有巨大应用潜力。
猪肉是我国居民食用肉类中占比最高且最重要的食用肉类。据统计，约三分之一的肉类因腐败变质而被浪费，造成极大的经济损失。猪肉富含蛋白质和脂肪使其在加工、运输、储存过程中极易因微生物增殖代谢、内源酶催化以及脂肪氧化发生腐败变质。普通瘦肉型猪种肌内脂肪含量2%~3%，而杜黑猪肉作为多元杂交品种（由小耳花猪、莱芜猪、圩猪、湘西黑猪等地方猪种和杜洛克猪经过数十年人工选育而成），其高肌内脂肪含量高达3%~10%，更易腐败变质。目前肉类保鲜主要为化学防腐保鲜、辐照处理等。这些方法虽有一定的保鲜效果，但存在安全风险且影响肉类品质。因此，开发安全有效的生物保鲜技术具有重要意义。
基于此，本研究从泡菜汁中分离得到一株副干酪乳杆菌Lab5，研究发现该菌株发酵上清液对低温下仍能生长的致病菌——单增李斯特菌具有显著抑制其生长的作用。通过测定其后生元热稳定性、pH稳定性、蛋白酶敏感性，及其在杜黑猪肉低温储藏中保鲜效果的应用研究，为解决高脂地方猪肉的保鲜难题提供新思路。
1.材料与方法
1.1材料与仪器
LB营养琼脂培养基、MRS肉汤 广东环凯微生物科技有限公司；胃蛋白酶（1:3000U）、肠激酶（5U/μL）、胰蛋白酶（1:250U）、木瓜蛋白酶（800U/mg）、蛋白酶K（30U/mg）、糜蛋白酶（1500U/mg） 上海麦克林生化科技股份有限公司；杜黑猪肉 广东壹号食品有限公司提供；单增李斯特菌ATCC19115（Listeriamonocytogenes）、大肠杆菌ATCC25922（Escherichiacoli） 广东省微生物研究所；乳酸菌 保存于华南农业大学食品学院应用微生物实验室，菌株来源信息如表1。
表 1 乳酸菌菌株来源信息
| 编号 | 菌株 | 来源 |
|---|---|---|
| MC2 | Lactococcus lactis strain 1931乳酸乳球菌 | 低温选育 黑水虻肠道 |
| Lab1 | Pediococcus pentosaceus strain CAU9541戊糖片球菌 | 泡菜汁 |
| Lab2 | Lacticaseibacillus casei strain 4412干酪乳杆菌 | 泡菜汁 |
| Lab3 | Pediococcus pentosaceus strain 2397戊糖片球菌 | 泡菜汁 |
| Lab4 | Pediococcus pentosaceus strain 4537戊糖片球菌 | 泡菜汁 |
| Lab5 | Lacticaseibacillus paracasei strain 4441副干酪乳杆菌 | 泡菜汁 |
| Lab6 | Lacticaseibacillus paracasei strain 1835副干酪乳杆菌 | 泡菜汁 |
| Lab7 | Lacticaseibacillus paracasei strain 20561副干酪乳杆菌 | 泡菜汁 |
| Lab8 | Pediococcus acidilactici strain 4355乳酸片球菌 4355乳酸片球菌 | 泡菜汁 |
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1.2实验方法
1.2.1不同乳酸菌菌液与其热灭活菌液的抑菌活性
单增李斯特菌作为革兰氏阳性指示菌，大肠杆菌作为革兰氏阴性指示菌，制备两种指示菌菌液（106CFU/mL）。乳酸菌菌液的制备：乳酸菌菌株活化后的菌液以1%接种量接种于50mLMRS液体培养基中，37℃培养48h。热灭活乳酸菌菌液：以上乳酸菌菌液经121℃处理25min。
牛津杯法检测其抑菌活性：在无菌平皿中倒入15~20mLLB营养琼脂培养基，静置冷凝。待培养基凝固后，加入100μL（1×106CFU/mL）指示菌菌液，用灭菌后的涂布棒均匀涂布，向培养基上放置已灭菌牛津杯，向牛津杯孔内注入200μL菌液或灭活菌液，37℃正立培养24h后测量抑菌圈直径。每个样品至少做两个复孔。
1.2.2不同组分发酵菌液的制备
热灭活副干酪乳杆菌Lab5菌悬液的制备：取热灭活菌液，10000r/min离心15min，收集菌体，并用PBS缓冲液（pH7.4）洗涤后于10000r/min离心15min，以洗去培养基，重复3次。将菌体重悬于PBS缓冲液至相同体积。副干酪乳杆菌Lab5发酵上清液的制备：取热灭活菌液，于10000r/min离心15min，收集上清液，经0.22μm微孔滤膜过滤。副干酪乳杆菌Lab5细胞裂解物的制备：取菌悬液在冰浴中超声破碎细胞（功率300W、工作时间2s、间隔3s、循环900次）。
1.2.3热稳定性
副干酪乳杆菌Lab5发酵上清液分别在60、70、80、90、100、121℃温度下处理25min后，冷却至室温，以室温（25℃）未经热处理的副干酪乳杆菌Lab5CFS为对照组，采用牛津杯法进行抑菌实验。
1.2.4蛋白酶敏感性
向热灭活副干酪乳杆菌Lab5CFS加入5%（v/v）相应蛋白酶，各蛋白酶终浓度为1.0g/L。用1mol/LHCl和1mol/LNaOH调pH分别至糜蛋白酶（最适pH8.0，37℃），胰蛋白酶（最适pH7.8，37℃），肠激酶（最适pH8.0，30℃），蛋白酶K（最适pH7.5，50℃），木瓜蛋白酶（最适pH7.0，60℃），胃蛋白酶（最适pH3.0，37℃）最适pH、温度下处理1h，然后将处理后的溶液pH调至上清液初始pH（3.50）。以不做酶处理的热灭活副干酪乳杆菌Lab5CFS作为对照组，进行抑菌实验。
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