一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)是一种广泛存在于哺乳动物体内的调节酶,具有催化生成一氧化氮的重要功能。


一氧化氮合成酶(NOS)是生物体内催化L-精氨酸合成NO的一类酶,主要存在于血管平滑肌、巨噬细胞、内皮细胞、神经细胞、肝细胞、肾小球膜细胞等各种细胞中。动物体内NOS有3种亚型,分别为神经元型NOS(nNOS)、内皮型NOS(eNOS)、损伤诱导型NOS(iNOS)。这三种亚型在不同的细胞和组织中有不同的表达模式和功能。


nNOS主要存在于神经系统中,在中枢神经系统(CNS)表达的nNOS与生物的学习、记忆等密切相关,外周神经系统(PNS)中nNOS产生的NO作为神经递质有着调节肠道蠕动、舒张血管的作用。eNOS主要存在于血管内皮细胞、肾小管内皮细胞等,血管内皮细胞eNOS产生的NO可抑制血小板聚集和黏附于血管壁,防止出现血栓,还可通过调控动脉粥样硬化相关基因的表达,阻止白细胞向血管壁的迁移和黏附,减少血管炎症,从而预防动脉粥样硬化。iNOS主要存在于与炎症反应相关的巨噬细胞、白细胞中,通常在细胞中不表达,但可被细菌脂多糖、细胞因子和其他诱导剂诱导表达,产生大量NO,引起DNA损伤和线粒体呼吸抑制等。


抗生素药物都是通过提高细菌的氧化压力而使细菌致死,NOS催化产生的内源性NO能够提高细菌对该类药物的抗药性,即NOS活性较强的细菌具有较强的耐药性。本文主要研究了细菌中的内源性一氧化氮酶如何在细菌内调节一氧化氮的生成的机制,以及NO的产生是如何引起这类细菌对各种广谱抗生素的耐药性。


Bioscreen全自动生长曲线分析仪的应用:


芽孢杆菌、炭疽杆菌加入含有不同抗生素的培养基中,于37度下进行培养,应用芬兰的Bioscreen-C全自动生长曲线分析仪各类细菌的OD值以便获取其生长曲线图,培养过程中摇晃15秒后然后隔20分钟测试一个OD(600nm)从而获得该细菌的生长曲线图。

图1、A)细菌一氧化氮酶保护细菌抵抗吖啶黄抗素生的机制。B)含有和缺少nos基因的炭疽杆菌在含有抗生素吖啶黄的环境中的生长情况分析(图中可以看出,缺失nos基因的炭疽杆菌溶液被抗生素杀死,而含有nos基因的炭疽杆菌具有一定的耐药性)。C)使用了抗生素ACR以及引入一氧化氮后细菌的吸收光谱变化情况。D)炭疽杆菌在含有一氧化氮、吖啶黄/NO、吖啶橙/NO、吖啶黄介质中的生长情况分析(OD)E)大肠杆菌细胞内的ACR浓度分布情况。F)NO保护细菌(枯草杆菌)抵抗抗生素ACR引发的细菌活性氧的增加。

图2、NO调节绿脓杆菌耐药性机制研究。A)吩嗪(PYO)的化学结构;B)枯草杆菌在不同条件下(氧化亚氮、加入PYO、葡萄糖等不同环境中)的生长情况分析;C)bNOS酶表达增强细菌对PYO的耐药性效果实验;D)炭疽杆菌在含有一样化氮和PYO抗生素一起培养的生长曲线情况分析。E)内源性一氧化氮保护枯草杆菌和绿脓杆菌中的炭疽杆菌对抗生素的耐药性研究;F)缺失SodA(超氧化歧化酶)枯草杆菌和正常枯草杆菌Z在含有一氧化氮和不含有一氧化氮的情况下对PYO抗生素的耐药性研究。从图中可以看出,缺失SodA(超氧化歧化酶)枯草杆菌对PYO敏感,溶液被抗生素杀死,而缺失nos酶基因的枯草杆菌对PYO抗生素没有那样敏感。G)bNOS控制Sod A蛋白的表达,采用了OD值测试细菌的生长曲线,其中左边的曲线表示的是乳糖甘酶的活性。

图3、bNOS酶保护细菌耐头孢呋辛的机制研究。图A表示的是头孢呋辛的化学结构;B表示的是金黄色葡萄球菌在抗生素头孢呋辛(CEF)存在下的生长情况分析。从图中可以看出,缺失nos基因的金黄色葡萄球菌对抗生素CEF敏感,其生长繁容易受到抗生素的抑制,而正常的金黄色葡萄球菌则对CEF表现出一定的耐药性;C表示的是不含有bNOS酶枯草杆菌菌株和正常的枯草杆菌6051对头孢呋辛环境中的存活情况分析。D表示的是细菌bNOS酶活性受抗生素刺激的影响,从图中可以看出正常细胞加入抗生素后,会增加细菌内的亚硝酸盐的生成,这是因为细菌内bNOS酶与抗生素反应后生成了更多的亚硝酸盐副产物。E)NO对缺少nos基因枯草杆菌在二联吡啶以及尿素中的存活率的影响。从图中可以看出,缺失nos基因的枯草杆菌中加入二联吡啶或尿素或一氧化氮后,该菌的存活率会增加。


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