存活PL的孢子在营养生长中的延迟可能是由于亚致死损伤，这些损伤会影响它们恢复活跃生长的能力而不改变其发芽。为阐明营养生长延迟的原因，制备了死细胞和活细胞的混合物，以获得与PL处理孢子悬浮液具有相同总密度和可培养孢子密度的细胞悬浮液（表1）。混合孢子群体的总细胞密度为10⁸细胞/mL，可培养细胞密度为10⁶（与1 J/cm²能量密度诱导的细胞密度相当）、10⁴（与2 J/cm²相当）或10²细胞/mL（与5.5 J/cm²相当）。然后比较PL处理孢子和混合群体的OD₆₀₀演变。
与发芽相关的OD₆₀₀下降的第一阶段在混合群体中未被检测到，因为可培养细胞数量低（图2）。对于相同的总和可培养细胞密度，发现PL处理孢子悬浮液比混合群体在开始营养生长方面有更明显的延迟。
图2 不同处理条件下枯草芽孢杆菌PL悬浮液的萌发与营养生长对比：连续线表示经处理的菌液，间断线表示由死活细胞混合组成的菌液（总细胞数与活细胞密度相同）。评估了10⁸个总细胞/mL及不同可培养细胞密度的群体：10⁶个/mL(a)、10⁴个/mL(b)或10²个/mL(c)。数据点为至少三次独立实验的平均值。
在30°C孵育6小时后，混合群体（10⁸总细胞/mL）含有10⁶可培养细胞/mL的营养生长明显，而当孢子以1 J/cm²处理时，即在导致相似可培养细胞密度的PL处理之前，未检测到OD₆₀₀的显著增加（图2a）。对于10⁴（图2b）和10²可培养细胞/mL（图2c）的群体密度，混合群体的滞后期分别为8和11小时，而先前接受PL处理的孢子分别为11和15小时。这些结果表明，与具有相同总细胞和可培养细胞密度的孢子悬浮液混合物相比，PL诱导了更长的滞后期。这可归因于存活PL的细胞在开始指数生长前必须修复PL处理造成的亚致死损伤，因此向生长群体的转变较慢。
细菌孢子发芽本质上是一个生物物理过程，涉及膜通透性变化、离子通量和降解孢子外层的酶的激活。由于PL处理诱导核酸、蛋白质和其他细胞结构如膜的修饰，不同的生理过程可能受到影响，从而参与营养生长的延迟。上述结果表明，暴露于0.3至2 J/cm²能量密度之间观察到的枯草芽孢杆菌计数减少（表1）不是由于细菌孢子的杀灭，而是由于PL处理亚致死损伤的细胞无法在琼脂上生长。只有施加的最高能量密度（12 J/cm²）阻止了孢子发芽和营养生长，
因此，可以假设孢子是死的。由于孢子必须具有完整的发芽装置才能在琼脂上恢复和生长，工艺效率的确定通常基于琼脂上回收的细菌孢子的测量灭活动力学。然而，如本研究所示，暴露于亚致死PL处理后，一部分孢子可能无法通过常规方法回收，但在某些条件下仍然存活并能够启动发芽过程。因此，在食品加工中应考虑灭活处理后存活孢子群体估计的这些差异，以确保有效处理。另一方面，尽管暴露于低总能量密度可能对孢子不是致死性的，但PL诱导的微生物细胞营养生长延迟可以延长液体食品（牛奶、果汁等）或表面去污固体食品的保质期。
PL处理对30°C孵育期间枯草芽孢杆菌细胞可培养性的影响
在30°C孵育的不同时间间隔确定PL暴露后枯草芽孢杆菌细胞的可培养性，并与具有相同总和可培养细胞密度的混合群体进行比较。如前所示，枯草芽孢杆菌计数的减少随总能量密度的增加而直接增加，在暴露于12 J/cm²后达到最大灭活水平（图3）。
图3 菌落形成单位（B. subtilis）在30°C TSB培养基中培养期间的可培养性。空心圆圈表示未经处理的孢子，实心圆圈表示经0.3 J/cm²光辐射处理的PL孢子，实心向上指三角形表示经1 J/cm²光辐射处理的PL孢子，空心向上指三角形表示总细胞密度为10⁶个/mL的孢子，实心方框表示经2 J/cm²光辐射处理的PL孢子，空心方框表示总细胞密度为10⁴个/mL的孢子，实心菱形表示经5.5 J/cm²光辐射处理的PL孢子，空心菱形表示总细胞密度为10²个/mL的孢子，星号表示经12 J/cm²光辐射处理的PL孢子。误差线表示95%置信区间。连续线表示检测限。
存活PL处理的细胞在营养培养基（TSB）中启动发芽和随后生长。在30°C孵育前应用低强度PL处理（0.3 J/cm²）不影响枯草芽孢杆菌细胞在30°C孵育期间的存活。然后，未处理孢子和接受0.3 J/cm²总能量密度的孢子的细胞密度在24小时孵育期间保持恒定（约10⁸细胞/mL）。然而，随着总能量密度的增加，指数生长期开始前的滞后期延长。
因此，暴露于1 J/cm²后发现6小时的滞后期，而在没有PL处理的相当孢子悬浮液中（10⁸总细胞/mL和10⁶可培养细胞/mL），在3小时前未观察到可培养性的显著增加。同样，暴露于2或5.5 J/cm²能量密度的孢子比具有相同总和可培养细胞密度的悬浮液表现出更长的滞后期。无论施加的处理强度如何，一旦营养细胞开始发育，培养物在14–24小时孵育后在稳定生长期达到10⁸ CFU/mL的密度。在暴露于测试的最高总能量密度（12 J/cm²）后，枯草芽孢杆菌的生长低于检测限（<10 CFU/mL）。这些结果支持先前从OD₆₀₀测量获得的结论，显示亚致死PL导致营养生长延迟。
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