摘要
本文旨在：分离鉴定具有良好降胆固醇能力的犬源植物乳杆菌（CLP），并评价其益生性和安全性。
方法：从比格犬粪便中分离、纯化并鉴定菌株，筛选出植物乳杆菌，进行胆盐解离能力和体外胆固醇去除率测定，选择具有最优体外降胆固醇能力的犬源植物乳杆菌51（CLP51）。对CLP51进行生化鉴定，通过测定生长曲线、产酸曲线、自由基清除能力、耐受性、疏水性、自凝聚力、抑菌性、抗生素敏感性和安全性，来探究CLP51的益生性和安全性。小鼠安全性试验将48只昆明系小白鼠随机分为4组（每组12只），每日分别灌服0.2 mL的生理盐水（CON组）及1×109（L组）、1×1010（M组）和1×1011（H组）CFU/mL的菌液，试验期28 d。
结果：1）筛选出4株植物乳杆菌均具有胆盐解离能力，CLP51性能最优，24 h时胆固醇去除率为24.34%。2）CLP51在15 h后进入生长稳定期，18 h后菌液pH稳定在3.9左右。3）CLP51对自由基清除率均较高，60℃处理后活菌数为1.35×108 CFU/mL，在pH=3的环境中和不同浓度胆盐中存活率均为90%以上，在人工胃液、肠液和胃肠液中的存活率分别为41.63%、100.21%、46.19%，表现为高度疏水和良好的自凝聚性，呈γ-溶血，菌悬液和无细胞上清液能够抑制致病菌的生长增殖。4）CLP51对小鼠体重、平均日增重、平均日采食量、器官指数无显著影响（P>0.05），H组的血清谷胱甘肽过氧化物酶活性显著高于CON组、L组和M组（P<0.05）。
结论：CLP51具有良好的体外降胆固醇能力、益生性和安全性，可作为犬源益生菌的候选菌株。
1 引言
当前宠物在人类生活中的地位越来越重要，人们对宠物的照顾也更加精细，开始更多地聚焦于宠物的饮食及身体健康。一项针对犬的调查研究发现，有29%～34%的犬被归类为肥胖，有5%～8%的犬甚至被诊断为超重，但宠物肥胖问题并未得到宠物主人的重视。超重的犬寿命会缩短，生活质量也会受到影响，骨关节炎、糖尿病、心血管疾病（CVD）和各种肿瘤的发病率也会上升。临床通常使用他汀类药物降低血液中胆固醇含量，但长期使用会对肝脏等器官造成损伤。研究发现，普通动物粪便中胆固醇含量比无菌动物多，食用乳酸菌或碳酸盐的婴儿血清中胆固醇含量有所减少，由此推测肠道微生物会对胆固醇的吸收产生一定影响。部分植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），如植物乳杆菌ATCC10012具有胆盐水解酶（bile salt hydrolase， BSH）活性，具有高胆盐水解酶活性的益生菌已被证明能够提高菌株在肠道的胆汁耐受性，具有降低胆固醇、促进心血管健康的作用。研究表明，植物乳杆菌可以调节高脂饮食饲喂小鼠的肠道微生物群，导致乙酸和丁酸含量增加，从而调节脂质代谢，并减少肝脏脂质积累。因此，植物乳杆菌可能被用于降低胆固醇、改善肥胖。在犬和猫饮食中使用益生菌可以改善肠道微生物群平衡、调节炎症、增强免疫功能，并防止肠道病原体引起的感染。
因其安全又有益的特性，益生菌在食品等众多行业得到了广泛的研究与应用。益生菌的特性与宿主特异性相关，研究认为从宿主本地微生物群中可以分离出最适的益生菌菌株，因为宿主源的菌株相比其他菌株黏附性更强，在胃肠道内的存活率更高。且与他汀类药物长期使用可能导致血清转氨酶活性升高、肝脏中毒等相比，益生菌更加安全且副作用更少。目前，宠物益生菌市场广泛，但效果良莠不齐，且宿主源益生菌的使用较少，并不能满足宠物市场的需求。因此，本研究旨在分离具有降胆固醇作用的犬源益生菌，对其进行益生性评价和安全性评价，为宠物宿主源降胆固醇益生菌制剂的制备提供参考和科学依据。
2 材料与方法
2.1 动物伦理声明
动物试验由青岛农业大学试验动物伦理委员会批准（批准号：DKY20240907）。
2.2 犬源植物乳杆菌（CLP）的分离鉴定
样本来自青岛市即墨畜牧实验场的1只成年健康雄性比格犬和2只成年健康雌性比格犬。使用无菌拭子采集直肠粪便后，置于含无菌生理盐水的无菌试管中，低温冷藏运输至实验室，即刻进行梯度稀释涂布，于37℃倒置培养24 h。多次分离纯化后获得纯培养物。对纯化菌株进行革兰氏染色和显微镜检，选取革兰氏染色阳性杆菌提取细菌DNA，使用细菌通用引物27F和1492R对所获菌株保守序列进行PCR扩增，扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳进行纯度检测后，回收凝胶送往北京擎科生物科技有限公司进行16S rRNA测序，测序结果在NCBI网站上进行同源性比对后构建进化树。
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