菌株构建
使用置换重组技术构建了在hdiR基因中携带64 bp框内缺失的MG1363突变株，以表达无假定的HTH基序的HdiR。为此，用引物p15/p16和p17/p18分别生成的PCR产物用Xbal/Pstl和Pstl/Sall消化，然后与Xbal/Sall切割的pGhost8连接。所得质粒pKS46在hdiR缺失位点编码两个额外的Ala残基，被导入MG1363，随后进行质粒整合和切除。携带hdiR框内缺失的突变株被指定为PV114。
PV114菌株通过将排除下游定位ynaA的PCR扩增hdiR基因区域作为Xbal-Sall片段克隆到pCI372上进行回补。所得质粒pKS47用于转化MG1363和PV114，分别得到KS73和KS74。
通过使用引物对p33/p34从IL1403扩增umuC区域，并将所得的1.78 kb PCR产物作为BamHI-EcoRI片段克隆到pCI372上，创建了MG1363和PV114中的umuC表达系统。所得质粒pKS50用于转化MG1363和PV114，分别得到PV121和PV122。
在MG1363和突变衍生物中创建HdiR的过表达系统如下。分别使用引物对p32/p18和p30/p31通过PCR生成hdiR结构基因和没有可能CtsR结合区域的ctsR启动子。PctsR和hdiR片段分别用EcoRI/BamHI和BamHI/Sall消化，然后与EcoRI-Sall切割的pCI372连接。所得质粒pKS49被转移到MG1363、DFAclpP和VEL1122中，分别得到KS78、KS79和KS80。
分子克隆技术基本上按照所述进行。
MG1363菌株中hdiR基因的鉴定
使用引物对p1/p2从MG1363扩增hdiR的内部基因片段，并克隆到大肠杆菌TOP10F'菌株的pCR2.1上。hdiR的5'区域通过PCR获得，使用根据IL1403中位于ynaB上游1.9 kb的ynaD预测蛋白质序列设计的引物p3，以及hdiR序列特异性引物p5。3'区域使用根据IL1403中位于ynaB下游200 bp的rpl/预测蛋白质序列设计的引物p4，以及hdiR序列特异性引物p6生成。所得PCR片段使用一组序列特异性引物在热测序酶荧光标记引物循环测序试剂盒指定的反应条件下进行测序。反应使用ALFexpress DNA测序仪进行分析。hdiR的基因区域已提交至DDBJ/EMBL/GenBank数据库，登录号为AJ557822。
使用NCBI BLAST2网络服务器进行序列比较。
RNA提取和Northern印迹分析
从在25℃或30℃指数生长至光密度OD600=0.3-0.4的乳酸乳球菌菌株中分离总RNA，然后将它们通过从25℃转移到38.5℃进行热应激，或保持在30℃并用3μM MMC处理。在38.5°C培养时于0、5、20或45分钟时间间隔取样，与MMC一起培养时于0、20、40和60分钟取样。RNA分离、印迹和用放射性标记探针杂交按他处描述进行。使用引物对p11/p12、p7/p8和p9/p10分别通过PCR生成来自MG1363的clpP和recA基因以及来自IL103的umuC基因的DNA探针。通过EcoRI消化从pKS36切出667 bp的hdiR特异性探针。使用GS-525分子成像系统扫描膜，并使用Quantity One软件进行定量。通过用针对乳酸乳球菌16S rRNA的特异性探针探测膜来校正膜上的RNA量。
PV114菌株的表征
通过平板实验研究野生型和PV114菌株在有或无MMC情况下的菌落形成能力。使用Bioscreen C生长曲线分析仪监测系统在30°C和37°C下比较生长速率。每孔含有300μl生长培养基，接种0.1%的过夜培养物。
使用Bioscreen C监测系统分析用pKS47回补PV114菌株。简言之，在30°C和37°C下培养含有pCI372的PV114和MG1363以及KS74和KS73。
HdiR的过表达和纯化
使用引物对p21/p22扩增hdiR编码区，用BamHI和Sall消化，然后克隆到pQE30的相应位点。根据Qiagen推荐的标准程序，从携带pQE-6His-hdiR的大肠杆菌M15[pREP4]中纯化His6-HdiR。纯化的His6-HdiR用于在兔中定制抗体生产和DNA凝胶迁移率变动实验。
凝胶迁移率变动
使用引物对p23/p24、p26/p27和p28/p29分别通过PCR生成对应于MG1363的hdiR、IL1403的umuC和recA假定启动子区域的DNA片段。使用引物p15和p25扩增含有IR2但不含IR1的hdiR上游区域。将寡核苷酸对退火，用T4多核苷酸激酶处理，并与Xbal-EcoRI切割的pBluescript-II SK+连接，分别得到pBluescript-IR1和pBluescript-IR2。使用M13 rev和M13 uni引物从pBluescript-IR1和pBluescript-IR2扩增230 bp片段用于凝胶迁移率实验。
通过将PCR扩增的片段和His6-HdiR在凝胶迁移缓冲液中混合来组装反应。通过使用在Tris-HCl或甘氨酸中于室温孵育16小时的His6-HdiR来研究自切割对DNA结合的影响。凝胶迁移反应在25°C孵育15分钟，随后在5%聚丙烯酰胺凝胶上电泳。用溴化乙锭染色凝胶，用Fluor-S成像仪扫描，并使用QuantityOne软件分析。