2.5.最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）
采用MTT法测定细菌细胞的增殖。简言之，将细菌细胞（10^6 CFU/mL）以200μL/孔接种到96孔微孔板中的Mueller-Hinton肉汤中。将贯叶连翘提取物的两倍系列稀释液加入到含有细菌细胞的孔中。在37°C培养24小时后，每个浓度进行三次重复测定（n=3）。24小时后，向每孔加入10μL MTT（5 mg/mL）试剂，并将板在37°C下孵育4小时。然后，加入DMSO（100μL）终止反应，轻轻摇晃板以重新溶解形成的晶体。使用Synergy 4微孔板读数仪（BioTek Instruments,Winooski,VT,USA）测量每孔的吸光度。所有结果表示为细胞增殖抑制率，计算公式为[（A-B）/A]x 100%，其中A和B分别为对照组和样品组的平均活菌数。MIC是抑制任何可见生长的测试样品的最低浓度。
MBC定义为杀死99.9%细菌接种物的最低浓度，通过将来自微孔板各孔的20μL培养物重新接种到Mueller-Hinton琼脂平板上确定。在37°C培养18小时后，通过肉眼观察琼脂平板上的细菌生长情况确定MBC。所有MIC和MBC测量至少重复进行两次。
2.6.时间-效应关系测定
在含有补充了5 mg/mL、10 mg/mL和20 mg/mL贯叶连翘提取物的新鲜制备的Mueller-Hinton肉汤的孔中，接种10^6 CFU/mL的藤黄微球菌，并在37°C培养。每小时通过自动测量600 nm处的吸光度（Bioscreen C,Labsystems,Helsinki,Finland）测定藤黄微球菌细胞的吸光度。
2.7.贯叶连翘提取物对藤黄微球菌细胞蛋白质的影响
用贯叶连翘提取物（5 mg/mL、10 mg/mL和15 mg/mL）培养8小时后，收集藤黄微球菌细胞（10^6 CFU/mL），并使用超声波方法提取总蛋白。然后，将样品与等体积的上样缓冲液混合，并通过12%SDS-PAGE进行分离。电泳后，用考马斯亮蓝（CBB）染色蛋白质，以检查藤黄微球菌细胞中的蛋白质组成。使用odyssey（Li-Cor,USA）对凝胶进行拍照。
2.8.流式细胞术
用贯叶连翘提取物（5 mg/mL、10 mg/mL和15 mg/mL）处理藤黄微球菌细胞。8小时后，收获藤黄微球菌细胞，并根据制造商的建议（天津华大基因生物技术有限公司，中国），在室温下避光用异硫氰酸荧光素（FITC）-Annexin V和碘化丙啶（PI）染色15分钟。使用配备CellQuest软件（BD Biosciences）的流式细胞仪（FACScan;BD Biosciences）分析细胞。将细胞分为活细胞、坏死细胞、早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞。计算早期和晚期凋亡细胞的相对比例以进行进一步比较。该实验重复超过三次。
2.9.TUNEL测定
使用凋亡原位检测试剂盒（Promega,Germany），通过末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）介导的dUTP缺口末端标记法，对凋亡细胞中DNA片段的3'-OH进行标记和染色，按照制造商的说明进行。使用荧光显微镜（Olympus,FV1000,Japan）捕获荧光素标记的TUNEL阳性细胞的图像。此外，TUNEL测定作为流式细胞术的补充方法进行，以比单独流式细胞术更准确地证明凋亡水平。细胞核用DAPI（Invitrogen,Molecular Probes,Eugene,OR）标记为蓝色，缺口末端标记为绿色。细胞核（蓝色）和缺口末端（绿色）标记之间的合并显示为紫色。
2.10.DNA Laddering测定
将藤黄微球菌细胞（10^5 CFU/mL）与贯叶连翘提取物（5 mg/mL、10 mg/mL和15 mg/mL）一起培养8小时。然后使用凋亡Ladder检测试剂盒（Beyotime,China）提取藤黄微球菌细胞的基因组DNA。然后将DNA在1.0%琼脂糖凝胶中进行电泳，并通过溴化乙锭（EB）染色显影。在紫外光下对凝胶进行拍照。
2.11.贯叶连翘提取物对膜电位的影响
将藤黄微球菌细胞与贯叶连翘提取物（5 mg/mL、10 mg/mL和15 mg/mL）在37°C下培养。八小时后，收集细胞，用冷PBS洗涤两次，用Rhodamine 123（Sigma,Germany）在37°C下染色30分钟，然后通过FACScanto（BD Biosciences）进行分析。
2.12.统计分析
所有数据表示为平均值±标准误（SE），所有统计分析均使用SPSS 17.0统计软件包（SPSS Inc.,Chicago,IL,USA）进行。此外，p<0.05被认为具有统计学显著性。
相关新闻推荐
2、老窖泥筛选分离的6株乳酸利用菌培养、发酵性能、生长范围（一）
3、生长曲线分析仪监测突变体在抗生素利福平处理后的生长恢复情况（二）