研究简介
结核分枝杆菌 （ Mtb ）是一种极其成功的胞内病原体，寄生于宿主巨噬细胞内。巨噬细胞、淋巴细胞和其他白细胞聚集形成典型的结核性肉芽肿，这种细胞环境被认为是缺氧 。细胞代谢在对 Mtb 感染的免疫反应中发挥着重要作用。本研究揭示了结核分枝杆菌（Mtb）在缺氧环境下通过代谢重编程逃逸宿主免疫的新机制。研究发现，Mtb在缺氧条件下通过上调磷酸丝氨酸氨基转移酶Rv0884c的表达，显著增加D-丝氨酸的分泌。这种代谢产物并不直接影响巨噬细胞对Mtb的杀伤能力，而是通过抑制CD8+T细胞的功能，间接削弱宿主的抗结核免疫应答。
通过体外实验和小鼠感染模型，研究团队发现D-丝氨酸能够显著降低CD8+T细胞中干扰素-γ（IFN-γ）的分泌，而IFN-γ是激活巨噬细胞抗菌功能的关键细胞因子。进一步机制研究表明，D-丝氨酸直接与CD8+T细胞中的WDR24蛋白结合，后者是mTORC1信号通路的上游调控因子GATOR2复合物的组成部分。这种结合破坏了GATOR2复合物的稳定性，抑制了mTORC1的活化，进而下调转录因子T-bet的表达，最终导致IFN-γ生成减少。研究首次将病原体的代谢适应与宿主T细胞功能抑制直接联系起来，提出了“代谢免疫逃逸”的新概念。这不仅深化了对结核病慢性感染机制的理解，也为开发新的免疫治疗策略提供了潜在靶点。
Bioscreen 全自动生长曲线分析仪的应用
Bioscreen全自动生长曲线分析仪用于定量监测细菌的生长动态，从而获取短小单胞菌属（Brevundimonas）菌株的生长曲线数据。将待测菌株接种于200 mL培养体系中，并置于Bioscreen C系统中进行培养。该设备通过连续、自动地检测培养液的光密度（OD值），以反映细菌细胞浓度随时间的变化。随后，以培养时间为横坐标、细菌数量的对数值或生长速率作为纵坐标，绘制出精确的生长曲线。提供了高通量、高重复性的OD数据，使研究人员能够准确比较不同Brevundimonas菌株（包括新种皮山短小单胞菌）的生长速率与延滞期、对数期、稳定期等生长阶段特征。
实验结果
缺氧条件会显著上调Mtb中磷酸丝氨酸氨基转移酶Rv0884c的表达和活性，进而导致其分泌大量的D-丝氨酸，而非L-丝氨酸。这一结论通过基因敲低（CRISPRi）和酶活性位点突变（F108A）实验得到了验证，证明Rv0884c是缺氧诱导D-丝氨酸产生的关键因子。研究揭示，D-丝氨酸并不直接影响巨噬细胞控制Mtb的能力，而是通过靶向适应性免疫的关键效应细胞——CD8+ T细胞，发挥其免疫抑制作用。具体表现为D-丝氨酸显著抑制了CD8+ T细胞产生干扰素-γ（IFN-γ），而IFN-γ是激活巨噬细胞抗菌功能的核心细胞因子。
阐明了一条清晰的信号通路：D-丝氨酸直接与CD8+ T细胞中GATOR2复合物的亚基WDR24结合，这种相互作用破坏了GATOR2复合物的功能，进而抑制了其下游的mTORC1信号通路。mTORC1的失活导致关键转录因子T-bet的表达下调，最终减少IFN-γ的生成。这一机制通过蛋白质互作、信号通路抑制和基因敲低等多种实验被完整地证实。体内感染实验表明，与野生型Mtb相比，感染Rv0884c敲低菌株的小鼠，其肺组织中D-丝氨酸水平降低，CD8+ T细胞产生的IFN-γ增多，细菌负荷显著减轻，病理损伤也更轻。而外源性补充D-丝氨酸则可逆转这种保护作用。
图1 、通过Rv0884c由缺氧诱导的分枝杆菌D-丝氨酸。a.在有氧或缺氧条件下孵育14天的H37Rv差异分泌的部分代谢物的热图(左)和相对面积(右)。b.在指示天数内，在有氧和缺氧条件下孵育的H37Rv培养上清液中D-丝氨酸浓度的测定。c.来自在有氧或缺氧条件下孵育14天的H37Rv细胞裂解物蛋白质组谱分析的丝氨酸代谢相关蛋白的倍数变化。d.在有氧和缺氧条件下孵育的H37Rv细胞裂解物的免疫印迹(IB)。使用ImageJ对Rv0884c和SigA蛋白水平进行定量，并在印迹下方标示。
e.在有氧和缺氧条件下，用或不用ATc孵育指示天数的Rv0884c_cKDTet菌株培养上清液中的D-丝氨酸浓度。f,g.来自感染H37Rv(f)或用DMSO或ATc处理的Rv0884c_cKDTet菌株(g)并在正常空气(-)或95% O2条件下孵育指示时间的BMDMs的Rv0884c mRNA的qPCR分析。h,j.来自感染H37Rv或Rv0884c_cKDTet菌株并用或不用ATc孵育指示时间的iBMDMs的培养上清液(h)或细胞裂解物(i)中的D-丝氨酸浓度。n.d.，未检测到。j–o.C57BL/6小鼠气溶胶感染GFP-H37Rv(J.k.m)、H37Rv(l)或Rv0884c_cKDTet，然后给予或不给予多西环素(n.o.)喂养4周。感染小鼠在处死前暴露于95% O2或正常空气20小时。NC，未感染小鼠。进行了肺PIMO(红色)、H37Rv(绿色)、F4/80(粉色)和 DAPI(蓝色)的免疫荧光染色。使用ImageJ对PIMO的平均荧光强度(MFI)进行定量(j)。分析了肺匀浆上清液(k.o.)和血清(l-n)中的D-丝氨酸浓度。p,q. C57BL/6小鼠气溶胶感染指示的Mtb菌株4周。
图 2、Rv0884c/d-丝氨酸会损害抗结核免疫力。a.在37℃有氧或缺氧条件下孵育14天，用或不用ATc孵育的Rv0884c_cKDTet的体外生长曲线。b.添加10 mM D-丝氨酸的H37Rv在37℃有氧(左)或缺氧(右)条件下孵育14天的体外生长曲线。c-f. C57BL/6小鼠气溶胶感染约每只小鼠200 c.f.u.的Rv0884c_cKDTet(用或不用ATc)、Rv0884c_cKDTet加ATc和D-丝氨酸、Rv0884c_cKDTet+Rv0884c(F108A)加ATc、以及 Rv0884c_cKDTet+Rv0884c加ATc。感染4周后，通过 H&E 染色(c；比例尺，200 μm(上)和 100 μm(下))、组织学评分(d)、抗酸染色(e；比例尺，20 μm(上)和 10 μm(下))和细菌负荷(f)评估感染小鼠肺切片的组织病理学。
不同条件之间的白细胞浸润区域用黄色虚线圆圈标记。g-j. C57BL/6 小鼠气溶胶感染约每只小鼠 200 c.f.u. 的 H37Rv，然后通过饮用水向一半感染小鼠给予 30 g/l D-丝氨酸。感染 4 周后，通过 H&E 染色(g；比例尺，200 μm(上)和 100 μm(下))、组织学评分(h)、抗酸染色(i；比例尺，20 μm(上)和 10 μm(下))和细菌负荷(j)评估感染小鼠肺切片的组织病理学。不同条件之间的白细胞浸润区域用黄色虚线圆圈标记。a-j 中的数据代表至少三个独立生物学重复的实验。结果以均值±标准差表示。使用 Tukey 多重比较检验的双因素方差分析(a,b)、Tukey 多重比较检验的单因素方差分析(d,f)和双尾非配对 Student t 检验(h,j)进行统计分析。
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