由于bfmA和bfmK组织在一个操纵子中，bfmK（ΔSmlt4208）的插入失活可能对整个操纵子的转录产生极性效应。为避免此缺陷，使用自杀载体pK18mobsacB通过同源双交换方法构建了bfmA和bfmK的框内缺失突变体（IFD-bfmA和IFD-bfmK）。同时，将全长bfmA和bfmK序列PCR扩增并插入广宿主范围载体pBBRMCS2的多克隆位点，构建两个重组载体。然后将重组载体转化到相应的突变体中以遗传互补突变（分别为菌株IFD-bfmA-bfmA和IFD-bfmK-bfmK）。在这两个构建体中，载体携带的bfmA和bfmK处于PlacZ启动子的控制下。测试了这些菌株的生物膜形成能力。如图4D所示，IFD-bfmA和IFD-bfmK突变体的生物膜量分别显著降低至野生型菌株水平的61%和53%，而遗传互补几乎完全抑制了由基因缺失引起的影响。还确定了这些菌株的细菌生长（图4E），结果显示bfmA和bfmK的框内缺失突变体以及互补的IFD-bfmK-bfmK菌株与野生型菌株生长相同。互补的IFD-bfmA-bfmA菌株比其他菌株生长更慢，这可能是由bfmA的过表达引起的，因为在其转录的Plac启动子在被测试的生长条件下具有高活性。这一结果再次排除了突变体中生物膜形成减少是由细菌生长缓慢引起的可能性。此外，bfmA和bfmK突变体的鞭毛、细胞外蛋白酶和淀粉酶活性以及对多种抗生素的敏感性没有显著改变（数据未显示）。综上所述，以上分析表明TCS BfmA-BfmK控制嗜麦芽窄食单胞菌中的生物膜发育。
使用ChIP筛选BfmA调控的下游基因
BfmA-BfmK TCS的调控子此前未被研究。我们使用STRING数据库预测了BfmA和BfmK可能的功能伙伴。根据基因组邻接、共现或不同物种中的基因融合事件等信息判断，BfmK和BfmA各自可能与10个蛋白质存在相互作用（评分>0.850）（见补充材料中的图S3A和B），其中三个是其他HKs（Smlt0977[PhoR]、RpfC[Smlt2234]和SmeS[Smlt4477]）。这些蛋白质中的六对，即PhoB-PhoR、Smlt1218-Smlt1219、Smlt1540-Smlt1541、Smlt3944-Smlt3949、SmeS-SmeR和BfmA-BfmK，它们本身在基因组中成簇分布，表明与TCS BfmA-BfmK有很强的功能关联。
由于BfmA是一个典型的OmpR家族RR，其C端输出结构域是一个转录因子（TF）区域（151至228个氨基酸），我们推测这些相关蛋白编码基因中的一些在转录水平上受BfmA直接调控。因此，我们通过DOOR数据库预测了这些相互作用蛋白编码基因的15个操纵子结构，并根据这些操纵子的预测启动子区域设计了PCR引物（见补充材料中的图S3C）。随后使用ChIP结合半定量PCR来筛选可能与TF BfmA结合的DNA。为进行此实验，我们构建了另一个bfmA互补菌株，类似于IFD-bfmA-bfmA菌株，但在bfmA序列的终止密码子5'端添加了His6表位标签编码序列。将该DNA插入片段克隆到pBBRMCS2载体中，用于互补bfmA突变体（菌株IFD-bfmA-bfmA）。使用针对BfmA-His6的单克隆抗体，基于该重组菌株（IFD-bfmA-bfmA）进行ChIP。如图5A所示，即使使用输入DNA样品作为DNA加样对照，也无法通过PCR扩增出PSmlt1216、PSmlt1423、PSmlt3944和PSmlt4477的启动子区域，表明这些顺式调控序列存在显著的遗传多态性。此外，PSmlt1436、PSmlt1540、PSmlt2233、PSmlt2700和PSmlt2801的PCR产物在样品中缺失，表明这些启动子不与BfmA结合。因此，上述九个启动子区域被排除在后续分析之外。然而，与使用来自缺乏His6标签的IFD-bfmA-bfmA对照菌株的共免疫沉淀DNA进行PCR扩增的背景对照相比，来自IFD-bfmA-bfmA*ChIP样品的PSmlt0570、PSmlt0800、PSmlt0978、PSmlt3568、PSmlt3949和PSmlt4209的PCR产物量显著增加（图5A），表明BfmA-His6在体内直接结合这些启动子区域，相应的基因或操纵子受BfmA调控。
bfmA正向调控其自身操纵子和Smlt0800的转录
为了评估BfmA对其下游候选基因的调控效果，我们选择了六个启动子区域可被BfmA结合的操纵子，并通过半定量RT-PCR比较了野生型菌株和IFD-bfmA突变体中mRNA的量。如图5B所示，未观察到代表性基因Smlt3949和Smlt3568的阳性扩增条带，表明在本研究使用的生长条件下它们的转录水平太低而无法检测到。Smlt0570和Smlt0978的mRNA量在测试的菌株中保持稳定（图5B），定量实时PCR也显示它们的mRNA水平在野生型菌株和bfmA突变体之间相似（见补充材料中的图S4）。这些结果表明，尽管存在TF-启动子结合事件，这两个基因的转录与BfmA的控制无关。Smlt0800和bfmK的转录水平在IFD-bfmA突变体中显著降低，而bfmA的遗传互补将其转录水平恢复至接近或高于野生型水平，表明BfmA作为正向调节因子调节它们的表达。
为了验证上述结果，采用定量实时PCR比较Smlt0800和bfmK的mRNA量。获得的结果与半定量RT-PCR测定结果非常吻合（图5C）；bfmA的框内缺失导致Smlt0800和bfmA的mRNA量分别减少60%和96%，并且这些减少几乎完全被突变体中bfmA的遗传互补所抑制（图5C）。综上所述，结果表明bfmA正向自动调节其自身操纵子的转录。此外，BfmA也是一个正向调节因子，控制Smlt0800的转录，该基因编码一种参与酰基-CoA水解的酰基-CoA硫酯酶（命名为AcoT）。
BfmA结合acoT的启动子区域以调控其表达和生物膜
为了验证体内ChIP-PCR结果并确定BfmA是否具有双链DNA结合活性，通过PCR扩增了bfmA-bfmK操纵子和acoT启动子区域的200 bp序列，用T4多核苷酸激酶和[γ-32P]ATP进行末端标记，并用作体外EMSA的探针。如图6A和B所示，BfmA重组蛋白与标记的PbfmA和PSmlt0800 DNA探针形成了稳定的蛋白质-DNA复合物。BfmA与两种探针的结合事件是特异性的，因为加入浓度递增的未标记DNA探针逐渐与32P标记的探针竞争，导致同位素信号减弱或完全消失。综上所述，体外和体内证据支持BfmA直接结合acoT和bfmA-bfmA操纵子的启动子区域并正向控制其转录的论断。
为了评估BfmA调控的acoT表达是否与生物膜相关，构建了acoT的框内缺失突变体（IFD-acoT）。如图6C所示，acoT的缺失导致细菌细胞聚集显著减少（38%）。虽然通过全长acoT基因进行遗传互补（菌株IFD-acoT-acoT）并未完全将缺陷恢复至野生型水平，但确实使突变体的细菌生物膜显著增加。此外，当acoT在bfmA突变体（菌株IFD-bfmA-acoT）中过表达时，由bfmA突变引起的生物膜缺陷被显著抑制，尽管未完全恢复。这些遗传实验表明acoT也参与生物膜发育，并且acoT转录减少是bfmA突变体生物膜缺陷的原因之一。
讨论
HKs是细菌用于检测环境刺激的主要细胞传感器；因此，它们被认为是开发新型抗生素化学品的候选分子靶点。基于对HK基因特征（62个基因）的生物信息学预测（图1），本研究成功构建了医院感染病原体嗜麦芽窄食单胞菌的51个HK基因突变体，并鉴定出许多在以下方面存在表型缺陷的突变体：菌落形态、细菌在半固体培养基上的游动能力以及在聚苯乙烯表面的生物膜形成（图2和3）。在这些HK基因中，分子分析揭示了一个TCS，即BfmA-BfmK（Smlt4209-Smlt4208），控制生物膜发育（图4D）。基于本研究收集的生物化学证据，BfmK是一个具有自动激酶和磷酸转移酶活性的HK（图4C），而BfmA是一个在体外和体内能够结合双链DNA的转录因子（图5和6）。通过STRING数据库搜索预测BfmA-BfmK系统可能的功能伙伴后，随后的ChIP-PCR筛选鉴定出六个被BfmA结合的启动子。定量实时PCR和EMSA表明，BfmA直接结合bfmA-bfmK操纵子和一个酰基-CoA硫酯酶编码基因（acoT,Smlt0800）的5'顺式调控序列，并正向调节它们的转录。结果表明BfmA-BfmK TCS具有自动调节功能，并控制acoT的mRNA水平，而acoT被证明参与生物膜形成（图6C）。据我们所知，这是首个系统研究嗜麦芽窄食单胞菌中TCS生物学功能的研究。它将促进我们未来旨在对抗这种细菌病原体引起的致命感染的研究。
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