摘要
生物素蛋白连接酶在生命三域中普遍存在。BPL的范例是大肠杆菌BirA，它也是生物素生物合成途径的阻遏蛋白。猪链球菌是猪疾病的主要细菌病原体，似乎是一种日益重要的人类机会性病原体。与大肠杆菌的情况不同，猪链球菌缺乏从头生物素生物合成途径。相反，它保留了bioY，一个编码生物素转运蛋白的基因，表明猪链球菌从其栖息地清除生物素的替代生存策略。本文报告了猪链球菌birA同源物的功能定义。通过其补充大肠杆菌birA条件致死突变体的能力，判断了与大肠杆菌对应物仅有23.6%同一性的birA旁系同源物的体内功能。猪链球菌的重组BirA蛋白在大肠杆菌中过表达，纯化至均一，并通过MS验证。纤维素TLC和MALDI-TOFF-MS分析均证明猪链球菌BirA蛋白催化其受体生物素羧基载体蛋白的生物素化反应。EMSA分析证实bioY基因与猪链球菌BirA结合。数据定义了链球菌中双功能BirA连接酶/阻遏蛋白的第一个例子。
引言
生物素（维生素H）是两种已知的含硫脂肪酸衍生物（生物素和硫辛酸）之一，作为酶辅因子在生命三域中普遍存在。尽管需要生物素的酶是稀有蛋白质（哺乳动物只有四种这样的蛋白质，而大肠杆菌只有一种生物素化蛋白质），但它们在原核生物和真核生物中脂肪酸合成、糖异生和氨基酸降解等某些重要反应（如羧化、脱羧和转羧化）中起关键作用。目前已知大多数微生物（细菌和真菌）和植物具有合成生物素的能力，而哺乳动物和鸟类则不能。生物素合成的早期步骤涉及大肠杆菌中修饰的II型脂肪酸合成途径，而生物素合成途径的后期涉及分别由BioF、BioA、BioD和BioB催化的高度保守的四步反应。鉴于生物素是一种能量消耗大的分子，估计每个生物素的从头合成途径消耗约15-20个ATP当量，细菌似乎已经开发出多种机制来严格监测体内生物素生产水平。除了保留生物素蛋白连接酶活性的大肠杆菌BirA调控系统外，至少还有两种调控机制被报道。其中一种是BirA与BioR（GntR家族转录因子）耦合的双蛋白系统，另一种是BirA与BioQ（TetR家族转录因子）耦合的双蛋白系统。
事实上，细菌进化出两种不同的机制来获得代谢所需的生物素辅因子，一种是从头合成途径，另一种是BioY转运蛋白介导的吸收系统。与人类病原体布鲁氏菌（一种编码上述两种系统以获得生物素的α-变形菌）不同，链球菌/乳酸球菌家族的物种似乎只有基于BioY的清除途径，并补偿了从头生物素合成途径的缺乏。在微生物中，需要生物素的范例酶是生物素羧基载体蛋白（缩写为BCCP，即乙酰辅酶A羧化酶的AccB亚基），它催化II型脂肪酸合成途径的第一个关键反应。
生物素蛋白连接酶在生命三域中广泛存在，因为它将生物素辅因子从某些中心代谢的关键酶的相关亚基的特定位点转移/附着。包括大肠杆菌和芽孢杆菌在内的大多数细菌只编码一个BPL来满足这种生理需求，而病原体新凶手弗朗西斯菌开发了一个额外的BPL以在感染宿主环境中获得竞争优势。通常，BPL成员分为以下两组（I组和II组），可以通过是否存在N端DNA结合域来轻松区分，该结构域允许BirA蛋白结合同源基因（例如，生物素操纵子），从而抑制生物素代谢的表达。与范例II组BPL蛋白（大肠杆菌birA基因产物保留DNA结合活性）不同，缺乏N端螺旋-转角-螺旋结构域的I组BPL仅作为负责蛋白质生物素化的酶起作用。特别是，II组BPL的调控作用取决于生理配体/效应物（生物素酰-5'-AMP）的参与，这是生物素利用/蛋白质生物素化的第一个连接酶半反应的产物。
猪链球菌是世界范围内猪产业中细菌性疾病（包括脑膜炎、关节炎和败血症）的主要病原体，并且似乎也是一种机会性人畜共患病原体，负责人类猪链球菌感染，如脑膜炎甚至链球菌中毒性休克样综合征。根据细菌荚膜的差异，35种血清型（1-34，1/2）被归因于猪链球菌。其中，猪链球菌血清型2经常从患病仔猪中分离，并与强毒力高度相关。猪链球菌2型是一种先前被忽视但新出现的人类病原体，声称引起一系列职业/机会性感染。自从1968年在丹麦首次记录人类SS2脑膜炎以来，SS2已传播到近30个国家（和/或地区）并引起不少于1600例人类病例。特别是，中国曾发生过两次大规模致命人类SS2感染暴发（一次在江苏省，1998年，另一次在四川省，2005年），对公共卫生构成重大关注。2007年，我们还报告了中国三例散发性人类SS2脑膜炎病例（深圳市两例，重庆市一例），暗示中国暴发和散发病例共存。不寻常的是，中国强毒SS2的流行菌株含有一个称为89K的致病岛。随后的功能探索表明，这个89K PAI表现得像转座子样遗传元件，并编码IV型分泌系统和SezAT毒素-抗毒素系统。我们的流行病学调查认为，89K PAI可能正在经历未知的选择压力，因为一些失去89K PAI的变体正在出现。细菌表面结构的重塑显著减弱了流行SS2菌株的完全毒力。最近，我们观察到D-半乳糖胺/N-乙酰-D-半乳糖胺分解代谢途径的调控与其传染性相关。细菌代谢的调控网络似乎复杂地涉及SS2毒力。鉴于生物素代谢和利用与弗朗西斯菌致病性相关，定义人类病原体猪链球菌2型中的生物素利用途径非常有趣。
在本文中，对中国流行SS2菌株，即具有已知基因组序列的猪链球菌05ZYH33，进行了细菌生物素代谢及其可能调控的背景分析。与范例生物大肠杆菌所见的情况不同，我们在猪链球菌中检测到的可能生物素机制包括一个由BirA双功能蛋白调控的单个BioY转运蛋白和需要生物素的底物蛋白AccB。通过采用从比较基因组学、生物信息学、生物化学/生物物理学、代谢组学到细菌遗传学的综合方法，我们试图呈现人畜共患病原体猪链球菌中生物素利用途径的全貌。
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