2.4.生物膜形成
近平滑念珠菌和克鲁斯念珠菌生物膜在商业可得的预灭菌聚苯乙烯平底96孔微孔板上形成。向板每孔加入210μl生长培养基中的标准酵母细胞悬浮液（OD600 nm=0.8）和70μl麦芽提取物培养基。实验对每种浓度进行十六个重复孔。
2.5.药物对粘附的效率
为了研究天然物质或抗生素对初始细胞粘附的影响，其中一种物质从一开始就与标准酵母细胞悬浮液一起加入孔中。微孔板用盖子覆盖并在30°C、150 rpm孵化24小时。
2.6.药物对生物膜发展的效率
为了研究天然物质或抗生素对生物膜发展的影响，含标准酵母悬浮液的微孔板培养24小时，然后加入其中一种物质。在药物加入前不洗涤孔以模拟天然作用机制的条件，其中物质与粘附和悬浮细胞相互作用。微孔板用盖子覆盖并在30°C、150 rpm孵化24小时。
2.7.药物对预形成生物膜的效率
为了研究天然物质或抗生素对预形成生物膜根除的影响，含标准酵母细胞悬浮液的微孔板培养24小时，然后每孔用盐水洗涤三次。然后向每孔加入适当浓度溶解于麦芽提取物培养基中的一种物质，培养再进行24小时。微孔板用盖子覆盖并在30°C、150 rpm孵化24小时。
2.8.Cellavista设备
Cellavista是全自动细胞成像仪，具备明场和三个荧光通道（标准集包括七个激发波长及相应滤波器）。光学系统由四个物镜组成：2x、4x、10x、20x和40x，以及提供4 Mpixel图像的CCD相机。Cellavista可评估6-384微孔板以及培养皿和显微镜载玻片。
一系列预定义应用可用（细胞融合度、悬浮细胞计数、细胞核等）。每个测定提供相关的图像处理算法，由算法评估的特定对象类型定义。参数评估设置可由用户为每个测定修改。
对于图像获取，微孔板放入设备中，可手动调整正确图像设置（曝光时间、光强度、增益、聚焦偏移）。然后扫描所选微孔板孔，图像自动拼接产生整个孔的图像。根据所选测定和用户定义参数，图像分析随后通过Cellavista评估算法对每个测定进行自动一致阈值处理。取决于测定类型，可为图像分析设置不同参数：例如细胞数量、细胞融合度、细胞或菌落大小和形态以及荧光应用中的荧光强度。设备还提供模板功能，允许一致评估相同布局的实验而无需手动调整。以二进制图像形式的结果（评估对象高亮）可作为所有图像的马赛克查看每个细胞（参见图1，描绘为时间过程）。对于96孔板，每孔可拍摄的最大图像数量见表1。
2.9.使用Cellavista设备评估药物效率
为了评估黄芩素、壳聚糖、地衣酸或两性霉素B对酵母生物膜形成不同阶段的影响，制备的96孔微孔板每孔用盐水洗涤三次，然后插入Cellavista自动显微镜，其中拍摄每孔底部中心二十五张照片（20x物镜）。这些图像通过Cellavista图像分析软件评估，确定参数：对比度、最小区域亮度、强度、灵敏度和大小。天然物质或抗生素对生物膜形成的影响与阴性对照（无药物培养）比较。所有实验中对照指定为100%以允许直接比较研究物质影响。
2.10.统计分析
对照和物质对粘附抑制、生物膜发展和预形成生物膜效率差异的显著性通过单因素方差分析和Tukey's HSD检验确定。
3.结果与讨论
3.1.抗真菌活性
生物膜的形成本质上与念珠菌属引起的慢性感染相关。许多研究已证实固着细胞对大多数可用抗生素的敏感性降低。因此发现和开发新的治疗剂至关重要。天然产物能够干扰生物膜形成的所有阶段。它们可以影响环境的物理化学性质、改变细胞包膜结构或干扰生物膜形成的调控系统。所有这些过程可以干扰细胞粘附和生物膜形成。由于天然物质与生物膜相互作用的机制复杂且通常属特异性，在特定微生物和条件下评估和描述它们的需求至关重要。
本研究选择了已知干扰生物膜形成的天然物质。低浓度黄芩素能够抑制白念珠菌生物膜形成，壳聚糖对多种微生物表现出抗菌活性，包括白念珠菌生物膜。地衣酸被描述为近平滑念珠菌固着细胞生长的有效抑制剂。
它们对研究近平滑念珠菌和克鲁斯念珠菌菌株的抗真菌活性测定为最小抑制浓度，显示在表2中。观察到的MICs完全在两种物种通常观察值范围内。
为了评估测试化合物对固着细胞的活性，进行了一系列浓度范围的初步实验，有效浓度结果显示在图2中。化合物效果以百分比（条形）描绘，相对于对照实验（指定为100%），因此低于100%的值代表细胞覆盖区域降低，超过100%的值指出物质影响增加生物膜覆盖度的实例。评估后选定的二进制图像（黑色区域代表生物膜）在条形图下方记录所有图中生物膜生物量的排列：物质对粘附的效率（行A）；物质对生物膜发展的效率（图像行B）；物质对预形成生物膜的效率（图像行C）。
每个单独图像是拼接图像集，显示一个孔的中心表面——是由Cellavista评估的25张图像的编译。在研究天然化合物中，壳聚糖和黄芩素在低浓度下影响粘附或预形成生物膜，但地衣酸即使在300μg ml⁻¹浓度下也未表现出足够的抗生物膜特性，因此被排除其他测试（单因素方差分析：近平滑念珠菌粘附抑制P=0.67，生物膜发展P=0.014，预形成生物膜P=0.15）。生物膜排列在所有对照实验中两种研究微生物中均匀。在大多数情况下，物质影响并均匀降低覆盖区域，除黄芩素外，其存在导致簇形成（白圈高亮），即使总覆盖区域降低，特别是在近平滑念珠菌生物膜发展实验中（行B，第二列）。