摘要：为了探明一株沙福芽胞杆菌（Bacillus safensis）的生长与产碳酸酐酶（carbonic anhydrase，CA）特性，采用单因素实验，研究了培养基初始pH、接种量、温度、摇床转速及Zn²⁺、Co²⁺、Cd²⁺、Mn²⁺、Mg²⁺、Ca²⁺等金属离子对细菌生长及其产CA活性的影响。结果表明，该菌株的最佳生长条件和产CA的最佳条件不同。30℃时，细菌生长最快，45℃时酶活性最高；细菌进入衰亡期酶活性达到最高。胞内外总CA检测结果表明，该菌株产胞内CA。加入0.010 mmol/L Mn²⁺，酶活性达2.46 U/mL，比对照组提高了2.6倍。
碳酸酐酶（carbonic anhydrase，CA）是一种以锌为活性中心的金属酶，广泛分布于动物、植物和微生物中。CA可以高效催化CO₂和HCO₃⁻之间的相互转化，已在强化CO₂捕集、利用及封存（Carbon Capture,Utilization and Storage,CCUS），驱动岩溶系统碳循环，修复水泥基和石质文物表面裂缝以及加固砂土等领域得到广泛关注。目前使用的产CA细菌大多是从岩溶土壤或水体中分离筛选出的，其中包括巴氏芽胞杆菌（Bacillus pasteurii）、蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）、巨大芽胞杆菌（Bacillus megaterium）和胶冻样芽胞杆菌（Bacillus mucilaginosus）等。
这些杆菌对高浓度CO₂有较强的耐受性，且产CA的能力强。Kaur等从印度碱土中分离出一株巨大芽胞杆菌（B.megaterium SS3），研究了pH对其生长和产CA的影响，结果表明，pH值为10.0时细菌生物量最大且CA活性最高，培养时间为96 h时酶活性最高。杨清清等以一株芽胞杆菌为出发菌株，研究了pH和温度对细菌生长和CA活性的影响，结果表明，细菌生物量最大和酶活性高的最佳培养条件为pH值6.0~7.0、培养温度30℃、培养时间32 h。Jaya等从海洋水样中筛选出一株产碳酸酐酶细菌（Bacillus safensis AS-75），通过单因素实验研究了pH、温度、Zn²⁺浓度及NaCl含量对其产CA活性的影响，结果表明，在培养基pH值9.0、4%（体积分数）NaCl、10 mmol/L Zn²⁺及培养温度32℃条件下，细菌分泌的CA活性高。李为等从西南岩溶生态系统分离出一株芽胞杆菌（GRT102Ca），研究了温度、pH、金属离子和阴离子对细菌CA活性的影响，结果表明，在20~30℃和pH值7.2时，胞外酶活性较高，1.0 mg/L Zn²⁺、0.1 mg/L Co²⁺、100 mg/L Ca²⁺和80 mg/L Mg²⁺均能不同程度地增强CA活性。易哲等从喀斯特地貌中分离出一株芽胞杆菌，研究了温度、pH、金属离子、阴离子对其CA活性的影响。结果显示，细菌CA在pH值为7.0~8.5、温度10~40℃时活性高，Fe²⁺和Zn²⁺在浓度低于0.01 mmol/L时能增强CA活性，而Ca²⁺和Mg²⁺对CA活性有抑制作用。
为了获得高活性的微生物CA，必须探明微生物的生长和产酶特性。本研究以一株沙福芽胞杆菌（Bacillus safensis）为供试菌株，研究了培养基初始pH、接种量、培养温度、摇床转速及Zn²⁺、Co²⁺、Cd²⁺、Mn²⁺、Mg²⁺、Ca²⁺离子对其生长和产CA活性的影响，以确定其最佳培养条件，为进一步应用提供参考。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株
菌株购自北纳生物微生物菌种保藏中心，经上海美吉生物医药科技有限公司通过16S rDNA序列鉴定，表明该菌株与沙福芽胞杆菌（Bacillus safensis）的同源性达99%。
1.1.2培养基
营养肉汤培养基（液体培养基）：牛肉膏3.0 g/L，氯化钠5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L；营养肉汤琼脂培养基（平板培养基）：液体培养基中加入琼脂15.0 g/L。
1.1.3试剂与仪器
细菌细胞裂解液：B-PER™Bacterial Cell Lysis Reagents（Thermo Fisher Scientific）。雷磁pH计（PRS-3G，上海仪电科学仪器有限公司）；Bio Photometer核酸蛋白检测仪（德国，艾本德）；恒温振荡培养箱（ZQZY-78AV，上海知楚仪器有限公司）；高压灭菌锅（GI54DWS，致微仪器有限公司）；全自动酶免分析仪（Synergy LX，BioTek Instruments Inc.）。
1.2方法
1.2.1菌悬液的制备
在超净工作台内，挑取一环平板培养基上的单菌落接种于100 mL液体培养基中。30℃、150 r/min恒温培养12 h后，取2 mL菌液于100 mL液体培养基中，30℃、150 r/min恒温培养6 h，用液体培养基调整菌液OD₆₀₀为0.5（Cell/mL=2.25×10⁸），作为备用菌悬液。
1.2.2菌液OD₆₀₀检测
在超净工作台内，取2 mL菌液，用液体培养基稀释3倍后在蛋白核酸测定仪上测定其OD₆₀₀值，平行测定3次，结果取平均值。