结果
分离耐金属硝酸盐还原ORR菌株。
为了确定ORR污染点是否存在微生物，能够通过硝酸盐还原在髙浓度金属存在下获取生长能量，配制了一种多金属混合物（COMM），包含八种金属（Al、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Cd和U），模拟ORR点S-3池塘附近高度污染井中地下水的金属。COMM的组成如表1所示。这代表了先前对ORR污染点80个不同地下水井分析中测量的金属浓度。例外是Mn和Al的浓度，在COMM中显著低于最严重污染井，以最小化使用的生长培养基中的沉淀问题。为了分离新菌株，设置了一系列超过2000个高通量富集，使用ORR未污染和污染区域的地下水和水沉积物作为接种物。未污染水定义为含铀量低于126 nM（EPA饮用水允许限值），这存在于ORR S-3池塘污染羽流外的井中。COMM添加到约90%的富集中，其余包含either 10倍较低浓度（0.1x COMM）或升高U浓度（100至400μM；COMM含100μM U）而无其他金属。硝酸盐使用浓度为20 mM或50 mM，也基于污染井中的浓度（表1）。富集中变化的其他参数包括碳源（乙醇、乳酸、富马酸盐、丙酮酸盐、葡萄糖、纤维素或堆肥茶）、pH（3.0至7.0）、氧合（好氧、微好氧[3%O2]或厌氧）以及存在硫酸盐（20 mM）而非硝酸盐或无末端电子受体添加。富集在22°C培养，生长在3个月内监测。从显示生长的富集通过平板分离获得分离物。
通过16S rRNA基因测序，获得21种新菌株，除六种序列外，所有序列均被多个独立分离物观察到。附有它们最接近的16S rRNA基因序列物种。它们代表多种细菌，包括一种放线菌、八种厚壁菌门芽孢杆菌纲菌株，以及十种变形菌门来自α-、β-和γ-变形菌纲。最常见的分离物是各种Rhodanobacter菌株，其中一种被分离17次，以及各种Bacillus菌株，有四种不同菌株，每种被分离3至7次。
这21种ORR菌株中的七种被选择进行深入研究，基于它们厌氧生长通过硝酸盐还原的能力（表2）。这些被命名为MT049、MT058、MT066、MT086、MT094、MT123和MT124。它们的富集条件及其最接近的16S rRNA基因序列分析亲属示于表2。七种菌株中，五种从ORR S-3池塘附近高度污染地下水接种的富集中分离，一种（MT049）来自未污染ORR地下水样品，另一种（MT058）来自未污染ORR土壤样品。它们包括两种Bacillus（MT066和MT094）和两种Paenibacillus（MT086和MT124）革兰氏阳性菌株，以及各一种Pantoea（MT058）、Castellaniella（MT123）和Serratia（MT049）革兰氏阴性菌株。七种菌株中的六种在存在至少20 mM硝酸盐下分离，而四种在存在COMM下分离，两种在存在0.1x COMM下分离，一种在存在200μM U无其他金属下分离（表2）。菌株分离使用的碳源包括甲酸盐、乙醇、葡萄糖、乳酸-富马酸盐混合物和堆肥茶。后者从商业堆肥设施获取的堆肥制备，用于富集两种Bacillus菌株和一种Paenibacillus菌株。
ORR菌株的碳源和pH依赖性。
七种ORR菌株在厌氧条件下生长于20 mM硝酸盐和指定碳源下的pH曲线示于图1。在大多数情况下，菌株分离来源的ORR地下水样品的pH值低于分离所用富集培养基的pH（表2）或分离物观察到的pH最适值（图1和表2）。例如，两种Paenibacillus物种（MT086和MT124）从具有最低pH（3.0）和大多数污染金属最高浓度的地下水（井FW126）分离（表1）。然而，MT086在pH 5.5富集，生长最适pH从6.0到8.0（图1），而MT124在pH 7.0富集，生长pH范围从5.5到8.0，最适pH 7.5（图1和表2）。没有分离物在pH 3.0生长；然而，所有三种革兰氏阴性分离物（MT049、MT058和MT123）以及一种Bacillus革兰氏阳性分离物（MT094）在pH 4.0有可测量生长（图1），每种情况都低于它们分离来源地下水的pH（表2）。Castellaniella物种菌株MT123是最耐酸的，最适pH 5.5，低于富集pH（6.5）。所有其他菌株的pH最适值显著高于分离所用培养基。例如，Bacillus sp.菌株MT066有围绕7.0的宽pH最适值，并在pH 5.5富集。
每种七种ORR菌株的pH最适值用于碳源和金属耐受性实验，生长使用六种不同碳源（甲酸盐、乙醇、富马酸盐、乳酸、丙酮酸盐和葡萄糖）在厌氧、硝酸盐还原条件下与20 mM硝酸盐测量。这在S-3池塘附近污染井的硝酸盐浓度范围内，变化范围9.2至188 mM（表1）。结果示于图2。三种菌株（MT066、MT086和MT123）无法在任何碳源上生长，除非硝酸盐存在，而其他四种菌株在至少一种碳源上存在硝酸盐时表现出生长增加。在无硝酸盐下能生长的菌株中，生长仅观察到丙酮酸盐和葡萄糖上。例如，Paenibacillus sp.菌株MT124仅在葡萄糖上生长，Pantoea sp.菌株MT058仅在丙酮酸盐和葡萄糖上无硝酸盐时生长。大多数菌株，包括两种Bacillus菌株（MT066和MT094）以及Castellaniella菌株（MT123），在硝酸盐存在下在所有或大多数测试碳源上显示显著生长。支持最高生长速率或硝酸盐存在下生长速率增加最多的碳源用于设计测定它们对金属响应和测量硝酸盐和亚硝酸盐还原酶活性的生长培养基。
ORR菌株的金属耐受性。
ORR S-3池塘附近污染地下水的定义特征之一是多种金属的升高浓度，这些金属以三种不同离子形式存在，取决于金属和氧化态。地下水含有升高浓度的阳离子Al3+、Fe2,3+、Cd2+、Cu2+、Co2+、Ni2+和Mn2+，氧阴离子CrO42-，以及氧阳离子UO2+。对所有七种ORR菌株获得了剂量响应曲线，使用所有这些金属，单独或与COMM。Al和Fe未包括在本研究中，由于沉淀问题（Al3+和Fe3+在我们的生长培养基中在pH>5.5和>3.0时沉淀）。还测定了所有七种菌株对硝酸盐和亚硝酸盐的敏感性。剂量响应曲线用于计算每种离子或COMM的半最大效应浓度（EC50）值，这些示于表3。
正如预期，所有七种菌株能够在高浓度硝酸盐存在下生长，EC50值范围从167 mM到显著的711 mM。这些浓度下的生长超过了ORR环境中观察到的浓度，其中最污染井（FW126）含188 mM硝酸盐（表1）。亚硝酸盐的EC50值低于硝酸盐，范围从9.0到77 mM。四种革兰氏阳性菌株中的三种（MT066、MT094和MT124）比亚硝酸盐的EC50值显著高于革兰氏阴性菌株（MT049、MT058和MT123）。然而，硝酸盐和亚硝酸盐耐受性之间似乎没有相关性。
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