培养基的统计参数设计（L27）
将鼠李糖乳杆菌细胞在MRS肉汤中培养，并以4%（v/v）接种至每种培养基中。使用L27（313）设计评估MRS培养基中10种成分对鼠李糖乳杆菌生长的影响。研究中的因素如表1所示。每个实验重复三次。
通过Box-Behnken设计优化培养基组成
基于正交设计实验对生物量显著变量的选择，选择以下显著变量：蛋白胨（X1）、葡萄糖（X2）和MnSO4·H2O（X3）。一旦选择相关变量的范围，使用Box-Behnken设计确定这些变量对生物量的最佳浓度。使用统计软件包制定总共17个实验。所有变量的中心值编码为零。
MRS培养基中微量元素的影响
基于正交设计实验（L27）对生物量不显著变量的选择，设计培养基组成实验如下：原始MRS、优化MRS（OPT）、无柠檬酸铵、或无K2HPO4、或无CH3COONa、或无MgSO4、以及无MRS中四种元素（mini-MRS）。微量元素对特定生长速率和最大生物量的影响参考先前的生长动力学分析方法。
衰减全反射傅里叶变换红外光谱
使用Thermo Nicolet Nexus FTIR仪器在中红外区域400 cm-1至4000 cm-1进行衰减全反射傅里叶红外光谱（ATR-FTIR）分析，扫描速度为16。为制备样品，将冻干细菌重悬于磷酸盐缓冲溶液（PBS）中并调整至相同OD600为10。将该悬浮液50μl允许在附着于分光光度计的金刚石晶体上空气干燥。FTIR光谱在波数区域800-1800 cm-1进行，随后使用SigmaPlot 10.0进行分析。
SDS-PAGE和聚类分析
对在不同培养基中于37°C培养6小时或24小时的鼠李糖乳杆菌ZY细胞进行SDS-PAGE分析。细胞在去离子水中洗涤，在4°C下以8000 xg离心10分钟，并以3至5倍稀释重悬于去离子水中。细胞在35 Kpsi下通过均质器破碎两个循环，然后将全细胞蛋白质在-20°C下储存用于后续实验。凝胶制备使用0.1% SDS的12%分离胶和4%堆积胶。Tris-甘氨酸缓冲液（pH 8.3）含0.1% SDS作为电极缓冲液。样品用样品缓冲液处理并在100°C加热5分钟，然后上样至凝胶。在Bio-Rad迷你凝胶电泳单元中，在室温下以每板20 mA恒定电流从阴极到阳极进行电泳，蛋白质通过考马斯亮蓝R-250染色显影。在样品制备中将蛋白质样品调整至相同细胞密度或蛋白质浓度。采用高斯模型的Quantity One分析用于通过SDS-PAGE发现差异表达蛋白质。通过比较MRS、OPT和mini-MRS实验，使用双向层次聚类方法计算显著差异，使用PermutMatrix软件如Donnini等人先前所述。
结果与讨论
益生菌筛选
分离菌株ZY为杆状、革兰氏阳性，具有白色光滑菌落，并在静态条件下烧瓶发酵期间具有产生乳酸的能力。基于这些结果，该菌株被鉴定为乳酸菌。16S rRNA序列表明分离菌株与鼠李糖乳杆菌密切相关。基于最相关物种16S rRNA序列的系统发育树分析（图1），该菌株被鉴定并命名为鼠李糖乳杆菌ZY（登录号KC012630）。该新菌株与鼠李糖乳杆菌LR2（登录号AY675254）相似度为99.1%，与玉米乳杆菌NRIC1947（登录号AB362765）相似度为97%，与副干酪乳杆菌NRIC0638（登录号AB362702）相似度为96.7%。
由于食品市场需求，开发更有效分离和表征新型益生菌株的方法并实现比已商业化菌株更好的益生特性非常重要。因此，我们的目标是使用商业益生菌产品筛选新菌株。通过对近完整16S rRNA样本测序，两个菌株分别被鉴定为鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌。由于生长能力和活力是益生作用和商业应用的重要前提，首先对两个菌株通过发酵研究其生长特性。鼠李糖乳杆菌ZY在发酵过程中显示出更快的生长速率和更高的生物量（数据未显示）。此外，由于已知并非所有乳酸菌都具有赋予宿主健康益处的能力，因此有必要对大量菌株进行表征以获得理想益生菌。因此，这些菌株也进行了功能表征。鼠李糖乳杆菌ZY在酸性pH、溶菌酶或H2O2中存活的更优异能力也得到确认。这两种能力被认为是益生作用的重要前提。因此，选择具有更好益生潜力的鼠李糖乳杆菌ZY进行进一步研究。
通过统计分析的L27培养基对细胞生长的影响
表1所示的正交实验设计（L27）包括10种成分的三个水平MRS，用于评估培养基效果。24小时生物量的OD600变化范围从0.76到1.89，分别对应运行7和运行2（表2）。
在运行2中观察到最高特定生长率，即μmax=0.46 h-1。结果表明，较高浓度的蛋白胨、酵母浸膏和葡萄糖是培养基中导致更高生物量生长的关键因素。使用表3中的应用ANOVA分析，蛋白胨、酵母浸膏和MnSO4·H2O对特定生长率有显著影响，置信P值<0.05。葡萄糖和MnSO4·H2O是关于生物量生长的两个主要因素（P<0.05）。
较高的微生物生长主要归因于作为氮源的蛋白胨和作为碳源的葡萄糖，它们是MRS培养基的主要成分。MnSO4·H2O被认为是负责生物量和特定生长率的最显著微量元素。锰是干酪乳杆菌的重要生长因子，因为它负责重要的乳酸脱氢酶。另一方面，镁也刺激双发酵乳杆菌的生长，不可否认的证据表明镁与正常细胞增殖直接相关，刺激DNA和蛋白质合成。此外，对于缺乏超氧化物歧化酶的物种（如植物乳杆菌），通过增加微生物的氧化应激抵抗力，镁对其最佳发酵和需氧生长至关重要。
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